血红素加氧酶-1基因修饰的骨髓间质干细胞抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的实验研究
2结果
2.1HO-1在骨髓间质干细胞中的表达HO-1为诱导型HO，其在正常组织细胞中的表达很低或不表达。以含HO-1质粒转染培养的骨髓间质干细胞48h，然后提取细胞的总蛋白，免疫印迹法证实HO-1质粒转染剂量依赖性地增加HO-1的表达(图1)，提示这种转染方法可有效促进质粒DNA进入干细胞并在其中表达外源性蛋白质。图1HO-1 质粒转染剂量依赖性地增加HO-1蛋白的表达Fig.1 HO-1 plasmid transfection in bone marrow mesenchymal stem cells dose-dependently increased HO-1 protein expression (n=3 in each group)与对照组相比，*P<0.01。
2.2表达HO-1的干细胞抑制共培养体系中肺动脉平滑肌细胞的增殖为明确骨髓间质干细胞所携带的HO-1基因表达产物能否抑制共培养的肺动脉平滑肌细胞的增殖，观察了5-羟色胺刺激的共培养体系中肺动脉平滑肌细胞的增殖。结果显示，在单一平滑肌细胞培养或野生型骨髓间质干细胞与平滑肌细胞的共培养体系中，平滑肌细胞经5-羟色胺刺激36h后细胞总数较对照组(无5-羟色胺刺激)分别增加了2.40或2.20倍(P<0.01)，但在表达HO-1的干细胞共培养体系中，相同浓度的5-羟色胺仅增加了1.56倍的平滑肌细胞总数(P<0.05，与野生型干细胞共培养体系相比)。同时，台盼蓝拒染率显示存活细胞大于97%。提示干细胞所携带的HO-1可以旁分泌的形式明显抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖(图2)。图2携带HO-1基因的骨髓间质干细胞抑制共培养体系中5-羟色胺刺激的肺动脉平滑肌细胞的增殖Fig.2 Bone marrow mesenchymal stem cells transfected with HO-1 plasmid inhibited the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells in response to serotoin in co-culture system (n=3 in each group)与对照组相比，*P<0.01;与5-羟色胺刺激的单纯肺动脉平滑肌细胞或野生型干细胞共培养体系中的肺动脉平滑肌细胞相比，#P<0.05。
2.3表达HO-1的干细胞抑制共培养体系中肺动脉平滑肌细胞RhoA的激活RhoA信号传导通路在肺动脉平滑肌细胞收缩及增殖中起着重要的作用，为探讨骨髓间质干细胞携带的HO-1基因抑制共培养体系中肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制，检测了5-羟色胺诱发的RhoA的激活。我们既往的研究已证实，5-羟色胺诱发平滑肌细胞中RhoA激活的峰值时间是10min[3]。故此，我们检测了5-羟色胺刺激细胞10min后RhoA的活性。结果发现，在单纯平滑肌细胞培养或野生型干细胞共培养体系中，5-羟色胺可使平滑肌细胞RhoA活性增加2.90或2.78倍(P<0.01，与对照组相比)，而在表达HO-1干细胞共培养体系中肺动脉平滑肌细胞的RhoA活性仅增加了1.47倍(P<0.05，与野生型干细胞共培养体系相比)。提示干细胞所携带的HO-1基因通过抑制RhoA的激活而抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖(图3)。
3讨论
肺血管重塑在各种类型肺动脉高压的发生中起着关键性的作用。肺动脉平滑肌细胞迁移、增殖导致肺血管壁增厚为肺血管重塑的主要病理基础。血管重塑引起的血管腔狭窄导致肺血管阻力升高，最终诱发肺动脉高压[3]。持续性的肺动脉高压可导致右心衰竭，甚至引起患者死亡，因而寻求有效的治疗方式和治疗靶点，有效抑制平滑肌细胞的增殖是肺动脉高压治疗的关键。图3携带HO-1基因的骨髓间质干细胞抑制共培养体系中5-羟色胺诱发的肺动脉平滑肌细胞中RhoA的激活Fig.3 Bone marrow mesenchymal stem cells transfected with HO-1 plasmid inhibited the activation of RhoA of pulmonary artery smooth muscle cells in response to serotoin in co-culture system (n=3 in each group)与对照组相比，*P<0.01;与5-羟色胺刺激的单纯肺动脉平滑肌细胞或野生型干细胞共培养体系中的肺动脉平滑肌细胞相比，#P<0.01。
骨髓间质干细胞是一种多能干细胞，可分化为血管内皮祖细胞及多种组织终末细胞，包括血管内皮细胞及平滑肌细胞。动物及临床研究证实，外周血中循环的血管内皮祖细胞数量减少或功能异常与肺动脉高压的发生有着一定的相关性[4-5]。缺乏或异常的血管内皮祖细胞可减弱机体对损伤血管内皮细胞的修复，导致肺血管的持续性收缩，参与肺动脉高压发生。移植血管内皮祖细胞或骨髓间质干细胞可促进内皮细胞的损伤修复，进而预防或治疗肺动脉高压的发生[5-6,9]。基因治疗肺动脉高压是最近几年刚起步的一个研究领域，骨髓间质干细胞以其独特的性能常被用作基因载体细胞。有学者探讨过以内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、降钙素基因相关肽(CGRP)及前列环素合成酶修饰的内皮祖细胞或骨髓间质干细胞治疗肺动脉高压的体内及体外研究，取得了令人鼓舞的结果[10-12]。HO-1为诱导型的热休克蛋白32，可降解血红素产一氧化碳(CO)、铁及胆红素。CO具有广泛的抗炎、抑制细胞增殖作用[13]。动物实验证实，增加HO-1的功能可预防或治疗动物模型中肺动脉高压的发生[7]。我们设想预先以HO-1 基因修饰骨髓间质干细胞再移植入动物或患者体内，HO-1产生的CO可以旁分泌的形式作用于肺血管平滑肌细胞抑制其增殖，减轻肺血管重塑，必将更有效地抑制肺动脉高压的发生。为探讨该种治疗方式的可行性，我们于体外将携带HO-1基因的髓间质干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养，观察携带HO-1基因的干细胞能否抑制平滑肌细胞的增殖，为肺动脉高压的基因治疗提供依据。
我们的研究结果提示，5-羟色胺可明显刺激肺动脉平滑肌细胞的增殖。野生型干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并不能抑制5-羟色胺刺激的平滑肌细胞增殖，但携带HO-1基因的骨髓间质干细胞则可明显抑制肺动脉平滑肌细胞增殖，提示干细胞携带的HO-1基因表达产物可以旁分泌的形式有效抑制平滑肌细胞的增殖。若将该种干细胞移植入动物或人体内，分化为血管内皮细胞后不但可修复损伤的血管内皮，亦可抑制平滑肌细胞的增殖，减轻肺血管重塑，从多个方面预防及治疗肺动脉高压。
我们进一步探讨了骨髓间质干细胞所携带的HO-1基因抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的分子基础。RhoA信号传导通路在肺动脉高压的发生中起着重要的作用。该通路的激活可诱发平滑肌细胞的收缩，促进平滑肌细胞的增殖，引起细胞外基质的重塑，从而导致肺动脉高压的发生[3]。动物实验证实，抑制RhoA信号传导系统可预防或治疗缺氧或monocrotalin诱发的模型动物中肺动脉高压的发生[14]。在本研究中我们发现，5-羟色胺可引起肺动脉平滑肌细胞中RhoA活性增加2.90倍，野生型干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并未能改变5-羟色胺刺激的RhoA激活，但在携带HO-1基因的干细胞共培养体系中，5-羟色胺诱发的RhoA活性明显降低，提示干细胞所携带的HO-1可以旁分泌的形式抑制RhoA的激活进而抑制细胞的增殖。HO-1作用的机制可能与其产生的CO通过激活cGMP信号通路进而抑制RhoA激活有关[3,15]。
在此研究的基础上，我们将进一步以携带HO-1基因的干细移植入肺动脉高压的动物模型体内，观察抑制肺动脉高压发生的可行性及效果，为肺动脉高压的干细胞/基因治疗提供实验依据。
【参考文献】
/[1/]WEITZENBLUM E, CHAOUAT A, CANUET M, et al. Pulmonary hypertension in chronic obstructive pulmonary disease and interstitial lung diseases /[J/]. Semin Respir Crit Care Med, 2009, 30(4):458-470.
/[2/]HAN MK, MCLAUGHLIN VV, CRINER GJ, et al. Pulmonary diseases and the heart /[J/]. Circulation, 2007, 116(25):2992-3005.
/[3/]LI M, SUN X, LI Z, et al. Inhibition of cGMP phosphodiesterase 5 suppresses serotonin signalling in pulmonary artery smooth muscles cells /[J/]. Pharmacol Res, 2009, 59(5):312-318.
/[4/]DILLER GP, VANEIJL S, OKONKO DO, et al. Circulating endothelial progenitor cells in patients with Eisenmenger syndrome and idiopathic pulmonary arterial hypertension /[J/]. Circulation, 2008, 117(23):3020-3030.
/[5/]MARSBOOM G, POKREISZ P, GHEYSENS O, et al. Sustained endothelial progenitor cell dysfunction after chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension /[J/]. Stem Cells, 2008, 26(4):1017-1026.
/[6/]UMAR S, DE VISSER YP, STEENDIJK P, et al. Allogenic stem cell therapy improves right ventricular function by improving lung pathology in rats with pulmonary hypertension /[J/]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009, 297(5):H1606-1616.
/[7/]MINAMINO T, CHRISTOU H, HSIEH CM, et al. Targeted expression of heme oxygenase-1 prevents the pulmonary inflammatory and vascular responses to hypoxia /[J/]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(15):8798-8803.
/[8/]GOLOVINA VA, BLAUSTEIN MP. Preparation of primary cultured mesenteric artery smooth muscle cells for fluorescent imaging and physiological studies /[J/]. Nat Protoc, 2006, 1(6):2681-2687.
/[9/]ZHU J, WANG XX, CHEN J, et al. Reduced number and activity of circulating endothelial progenitor cells in patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension /[J/]. Respir Med, 2008, 102(7):1073-1079.
/[10/]KANKI-HORIMOTO S, HORIMOTO H, MIENO S, et al. Implantation of mesenchymal stem cells overexpressing endothelial nitric oxide synthase improves right ventricular impairments caused by pulmonary hypertension /[J/]. Circulation, 2006, 114 (1 Suppl):I181-185.
/[11/]DENG W, STHILAIRE RC, CHATTERGOON NN, et al. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in vitro by genetically engineered marrow stromal cells secreting calcitonin gene-related peptide /[J/]. Life Sci, 2006, 78(16):1830-1838.
/[12/]TAKEMIYA K, KAI H, YASUKAWA H, et al. Mesenchymal stem cell-based prostacyclin synthase gene therapy for pulmonary hypertension rats /[J/]. Basic Res Cardio, 2009, 105(3):409-417.
/[13/]CHUNG HT, PAE HO, CHA YN. Role of heme oxygenase-1 in vascular disease /[J/]. Curr Pharm Des, 2008, 14(5):422-428.
/[14/]OKA M, FAGAN KA, JONES PL, et al. Therapeutic potential of RhoA/Rho kinase inhibitors in pulmonary hypertension /[J/]. Br J Pharmacol, 2008, 155(4):444-454.
/[15/]HYVELIN JM, MAUREL B, UZBEKOV R, et al. Hemin prevents in-stent stenosis in rat and rabbit models by inducing heme-oxygenase-1/[J/]. J Vasc Surg, 2010, 51(2):417-428.