AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用

　　2.3AngⅡ对NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用实时定量RT-PCR结果显示，AngⅡ可诱导NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达上调，且以时间依赖模式上调，p47phox mRNA从4h开始有统计学差异(P<0.05)，至12h到达峰值(图4)。Western blot结果显示，AngⅡ可诱导p47phox蛋白表达以时间依赖模式上调，从12h开始有统计学差异(P<0.05)，至48h达峰(图5)。图4AngⅡ诱导NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA的表达情况Fig.4 Ang Ⅱ induced NADPH oxidase subunits p47phox mRNA expression (n=4)4、8、12、24h vs. 0h，P<0.05。　　图5AngⅡ诱导NADPH氧化酶亚基p47phox蛋白的表达情况Fig.5 Ang Ⅱ induced NADPH oxidase subunits p47phox protein expression (n=4)　　12、24、48、72h vs. 0h，P<0.05。PMCs经AGI预处理后，再行AngⅡ体外刺激，可显著逆转由AngⅡ诱导的NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达上调，C组、D组分别与B组比较，具有显著差异(P<0.05)，但未观察到C组与D组有显著性差异，AGI对p47phox mRNA表达的抑制度不依赖浓度模式(图6)。图6AGI预处理可显著逆转AngⅡ诱导的NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达的上调Fig.6 AGI pretreatment could reverse Ang Ⅱ’s induction of NADPH oxidase subunits p47phox mRNA expression(n=4)A：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)组;A vs. B，P<0.05;B vs. C，P<0.05;B vs. D，P<0.05。

　　3讨论

　　腹膜纤维化是腹膜透析的重要并发症之一，对其发病机制的不断探讨、寻找新的治疗靶点及有效干预剂是腹膜透析进一步发展的迫切需要。AngⅡ不仅作为一种血管活性物质参与RAS的活化效应过程，而且局部产生的AngⅡ作为一种重要的生长因子参与调节细胞的增值、凋亡及纤维化进程，是引起腹膜纤维化的重要因子之一[10-12]。NADPH氧化酶是一种过氧化物酶, 广泛存在于吞噬细胞及非吞噬细胞，其催化产物活性氧( reactlve oxygen species, ROS) 参与机体防御和信息传递等许多生理过程。NADPH氧化酶主要由5个亚基组成，包括2个膜亚基：gp91phox、p22phox;3 个胞浆亚基：p47phox、p40pox、p67phox。另外，还有2个低分子量的GTP结合蛋白Rap1A和rac2。当细胞受到相应刺激后, 胞浆亚基p47phox被磷酸化激活，与p67phox结合并向胞膜转位，与胞膜亚基结合组成有氧化活性的复合体，将氧催化为-O2-，进而产生一系列活性氧，造成细胞损伤。NADPH氧化酶作为ROS的调控酶，其胞浆亚基p47phox在多种组织的氧化应激反应中起着始动、枢纽性作用[13-15]。如前所述，色谱指纹图谱证实黄芪注射液有稳定的清除自由基、抗氧化的色谱峰，其拮抗高糖环境对腹膜间皮细胞的氧化应激损伤的作用已被证实。该实验研究中，在AngⅡ作用下，ROS的产生明显增加，腹膜间皮细胞NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA和蛋白结果一致，均呈时间依赖模式的表达上调。我们应用黄芪注射液预处理后发现，黄芪不仅可明显减少由AngⅡ诱导的腹膜间皮细胞ROS的产生，而且可使NADPH氧化酶亚基p47phox的表达降低。该实验表明黄芪不仅能够抑制NADPH氧化酶的表达，而且可抑制其活性。 由此我们推测，黄芪通过抑制腹膜间皮细胞NADPH氧化酶的表达及其活性，从而减少腹膜间皮细胞ROS的产生，阻断ROS在其中的信号传导作用，及下游因子TGF-β的过度表达，减轻细胞的转分化和细胞外基质的积聚，增加细胞外基质的降解而发挥其延缓腹膜纤维化的作用。

　　综上所述，长期腹膜透析患者，腹膜间皮细胞暴露于腹透液高糖、低pH值、乳酸盐和葡萄糖降解物GDP等多种生物不相容因素下，可导致腹膜纤维化，AngⅡ、ROS、NADPH氧化酶均参与其中。腹膜间皮细胞经AngⅡ刺激，其ROS产生明显增多。ROS产生增多与其调控酶——NADPH氧化酶的表达上调密切相关。黄芪注射液能够抑制NADPH氧化酶的表达，减少腹膜间皮细胞ROS的产生，从而减少腹膜的氧化应激损伤，延缓腹膜纤维化的发生发展。

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