辣椒碱纳米乳注射剂的制备及其体外评价
2.7 辣椒碱纳米乳含量测定
2.7.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇水磷酸（体积比70∶30∶0.1）；荧光检测波长为λex=283 nm,λem=310 nm；流速为1. 0 mL·min-1；进样量为20 μL。辣椒碱保留时间12.3 min，理论塔板数4 156，拖尾因子1.13，峰形对称，色谱图见图4A。
2.7.2 样品溶液的制备 精密称取0.10 mg辣椒碱对照品，无水乙醇溶解并定容至10 mL，取该液1. 0 mL，无水乙醇稀释至10 mL，摇匀，制得1.0 μg/mL辣椒碱对照液。精密量取0.004%辣椒碱纳米乳0. 30 mL（约相当于辣椒碱12 μg），无水乙醇溶解并定容至10 mL，超声混匀，制得1.2 μg/mL辣椒碱供试液。精密量取不含辣椒碱的空白纳米乳0.30 mL，同法制得阴性对照液。
2.7.3 方法专属性考察 分别量取对照液、供试液及阴性对照液20 μL，按上述色谱条件测定，结果表明，空白基质无干扰，且供试液与对照液保留时间基本一致，见图4。
图4 3种样品溶液荧光HPLC图（略）
Figure 4 FluorescenceHPLC of three samples
2.7.4 标准曲线绘制 精密称取辣椒碱对照品0. 20 mg于10 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得20 μg/mL辣椒碱标准储备液。精密吸取该储备液0.1、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0 mL置10 mL容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度对照液。分别进样20 μL，按上述色谱条件测定，以对照液质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，计算回归方程为：A=4×106ρ-224614，r=0.999 7，结果表明辣椒碱在0.20～6.00 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。以信噪比（S/N）＝3计算，测得辣椒碱最低检测限为0.1 ng。
2.7.5 精密度试验 取 0.1 μg/mL辣椒碱对照液，连续进样5次，测得平均峰面积为10 012 711，RSD为0.54%，表明仪器精密度良好。
2.7.6 重现性试验 按上述方法制备浓度为0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 μg/mL的辣椒碱供试液，各3份，以1. 0 μg/mL辣椒碱对照液的峰面积定量，结果各浓度辣椒碱含量平均值为91.10%、94.94%、91. 03%、91.01%、90.04%；RSD（n=3）为0.37%、0.85%、0.25%、0.42%、1.7%，表明本方法重现性良好。
2.7.7 稳定性试验 取供试液适量，分别于室温放置0、2、4、6、8、12、24 h后按色谱条件测定，测得峰面积日内RSD为0.32%（n=7），表明供试液在24 h内稳定。每天测1次，连续测5 d，峰面积日间RSD为1.5%（n=5）。
2.7.8 回收率试验 精密量取0.50 mL空白纳米乳15份，分3组，置10 mL容量瓶中，分别加入20 μg/mL辣椒碱标准储备液0.40、0.50、1.00 mL，各5份，无水乙醇定容，超声混匀，0.45 μm滤过，精密吸取续滤液20 μL按上述色谱条件测定，外标法计算回收率。结果高、中、低浓度平均回收率分别为100.14%、102.56%、107.25%，RSD值分别为1. 30%、0.83%、0.58%（n＝5），见表7。
2.7.9 含量测定 精密量取0.004%辣椒碱纳米乳0.50 mL，无水乙醇溶解并定容至10 mL，超声混匀，得辣椒碱供试液；另精密称取辣椒碱对照品适量，无水乙醇配成2.0 μg/mL辣椒碱对照液。分别吸取辣椒碱供试液、对照液20 μL，按上述色谱条件测定，外标法计算含量。结果3个批号辣椒碱含量分别为94.50%、94.55%和94.10%。
表7 辣椒碱纳米乳回收率（略）
Table 7 Recovery of capsaicin nanoemulsion
2.8 辣椒碱纳米乳包封率测定
包封率测定方法参照文献［13］:量取0.004%辣椒碱纳米乳0.3 mL滴到葡聚糖凝胶柱中心，2 000 r/min离心5 min，洗脱液用无水乙醇溶解并定容至10 mL，超声混匀，按“2.7.1”项色谱条件测定，将峰面积代入标准曲线计算药物浓度。根据式1-1计算辣椒碱纳米乳的包封率。
包封率＝（ρ包封/ρ总药）×100% （1-1）
式中ρ总药表示辣椒碱总质量浓度，ρ包封表示纳米乳中被包封辣椒碱质量浓度。测得3批辣椒碱纳米乳的包封率分别为85.83%、84.50%、85.34%，RSD为0.79%。见表8。
表8 辣椒碱纳米乳包封率（略）
Table 8 Entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion
3 讨论
3.1 影响乳滴粒径因素
3.1.1 油、表面活性剂种类 油、表面活性剂种类是影响乳滴粒径的重要因素。根据纳米乳形成机理，当表面活性剂的亲水亲油平衡值（HLB）与油所需HLB值相当时，形成纳米乳较稳定［14］。当油、表面活性剂浓度不变，分别以大豆油、油酸乙酯、MCT为油相，形成乳滴粒径由小到大排列：吐温80＜泊洛沙姆F68＜豆磷脂。可见，乳化剂乳化能力由强到弱排列：吐温80＞泊洛沙姆F68＞豆磷脂。同时，表3结果也表明，乳滴粒径随吐温80增加、豆磷脂减少而逐渐减小，说明吐温80乳化能力较强。制备O/W型乳剂，所需乳化剂的HLB值在8～16范围内，吐温80的HLB值为15.0；而豆磷脂仅3. 0，脂溶性过强，在水相体系中分散性较差，难以在油水两相中很好的分配；相反，泊洛沙姆F68的HLB值为29.0［12］516-519，亲水性强，不能在油水界面大量吸附，也难以形成牢固的界面膜，故乳化能力均较差。
油的种类同样影响微乳的形成。如表1所示，吐温80作乳化剂，油酸乙酯或MCT为油相时均能形成透明微乳，而大豆油不能，这可能与大豆油为长链植物油，较难乳化有关。依据文献［15～18］报道，油相分子的大小以及碳链的长短影响微乳的形成：油相分子体积越小，对药物的溶解能力越强；碳氢链越短的油越能嵌入表面活性剂中形成界面膜，所得微乳相图区域越大。反之，碳氢链过长的油则不易形成微乳。因此，油酸乙酯、MCT较大豆油易乳化。
3.1.2 表面活性剂用量 当油、表面活性剂种类固定时，表面活性剂用量显著影响乳滴粒径的大小。如表2所示，吐温80∶MCT的质量比由1∶1增大到4∶1时，透光率由0.5%增大到99.6%，可见乳滴粒径随表面活性剂用量增大而减小。文献［19］也说明，纳米乳中乳化剂的用量为油量的20%～30%，而普通乳中乳化剂多低于油量的10%。这是因为纳米乳乳滴小界面积大，表面能高，需要浓度更高的乳化剂才能有效降低表面能，形成纳米乳。但考虑到毒性，在形成纳米乳前提下表面活性剂的用量应尽可能少。
3. 2 影响包封率因素
除了油的种类影响乳滴粒径以外，油的浓度是影响纳米乳包封率的关键因素。当MCT由0.15 g增大到1.50 g时，包封率由20.07%提高到85. 22%。这是因为当辣椒碱浓度不变时，增大油的量，乳化剂、助乳化剂按比例增加，药质比随之提高，使更多药物溶解在油、乳化剂、助乳化剂组成的均相中，形成均匀透明的溶液；遇水乳化后药物被包裹的比例随之提高。此外，表5、表6说明乳化温度与油、水滴加顺序对辣椒碱纳米乳包封率的影响不大。
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