尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序
2 结 果
2.1 Agacutin纯品鉴定
Agacutin纯品经SDSPAGE电泳鉴定，在16和15 kDa处显示相近的2条带(图1)。在该电泳条件下，2 μg的上样量显示亚基得到有效分离。
2.2 单亚基鉴定
Agacutin纯品经SDSPAGE电泳分离，可逆性蛋白快速染色，分别切下含2个亚基的条带，经电泳洗脱亚基单肽链。回收的亚基在SDSPAGE电泳胶上分别显示16和15 kDa的单一条带(图2)。
2.3 亚基电转移
电洗脱回收的2个亚基，经SDSPAGE电泳浓缩为狭窄的条带，电印迹到PVDF膜，经考马斯亮蓝染色和脱色液脱色后，分别显示为单一蛋白条带(图2)。
2.4 亚基测序
2.4.1 对照样品测序结果 阳性对照见图3A，阴性对照见图3B。
2.4.2 小亚基测序结果 15 kDa亚基N端15个氨基酸残基序列为DSSGWSSYEGHEYYV,见图4。
2.4.3 大亚基测序结果 16 kDa亚基序列为DCSSGWSSYEEHQYY，见图5。
3 讨 论
自20世纪70年代起，许多蛇毒蛋白酶如Ancrod、Batroxobin、Crotalase和Reptilase (立止血)等先后被发展成临床药物。这些药物在血液止血和栓塞疾病的治疗中扮演一定的角色。由于立止血在临床上的有效性和低毒性，该类凝血酶在1996年已成为国家基本药物。尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)主要分布在我国华南、台湾和泰国、缅甸，因此该蛇毒的研究主要集中在亚洲各国。根据SDSPAGE技术和家兔血凝固时间变化，筛选了止血蛋白Agacutin。在该蛋白酶的纯化过程中，尖吻蝮蛇蛇毒中许多分子量、等电点和凝结活性相近的蛇毒蛋白长时间地影响了纯化工艺。
Figure 5 Nterminal 15 amino acid residue sequencing of 16 kDa subunit 本研究采用SDSPAGE电泳方法，对组成类凝血酶Agacutin的16和15 kDa亚基进行了分离。通过切割分离含2个亚基的胶条，电洗脱回收，得到了单一亚基条带，并转移至PVDF膜进行了成功测序。从SDSPAGE图谱可知，该蛋白质的15和16 kDa两亚基非常相近，如果一种测序样品混合了很少量的另一种亚基肽链，测序结果可能不可靠。此外，拆分和测序结果成功与否，还取决于回收样品的鉴定结果和量。鉴于方法学的限制，本来就极少量的亚基纯品，在资金和仪器条件限制下，其鉴定过程就更加困难。本文通过SDSPAGE、亚基胶条回收和电转移技术相结合，简单地解决了这样的测序问题，即使纯化样品纯度不高，该方法也很有效，所以该亚基分离方法和测序有一定的实际意义。
SDSPAGE分析显示，Agacutin是一个15和16 kDa亚基组成的异二聚体。大亚基N端15个氨基酸残基序列为DCSSGWSSYEEHQYY和小亚基序列为DSSGWSSYEGHEYYV。通过NCBI Blast序列比较分析，15和16 kDa亚基分别与凝血因子X结合蛋白Agkisacutacin的A链有最大66.7%和73.4%的序列同源性(GenBank accession no.1WT9 A [gi / 93278427], Chain A, Crystal Structure of AaXBpI, A snake venom protein from Deinagkistrodon acutus snake venom)。
按照新药申报模式，I类新药的蛋白质药物，必须测定N端15个氨基酸残基，以确定它是否是新的蛋白质。因为这样的N端序列完全同源有10-15可能性，所以该测序结果可直接为该化合物的申报奠定坚实的基础。另外，在该蛋白/基因的全序列未得出前，不能获得很多有益的信息。因为，对于接近300个氨基酸残基的蛋白质来说，N端15个序列显得太少。
蛋白亚基之间多由比较复杂的键相连接，主要有二硫键、离子键、疏水键等。在还原电泳条件下，Agacutin亚基间的化学键被破坏，各亚基根据自身分子量大小排列而得到分离。本研究正是借助这种机理，将2个非常相近的亚基分离，并转移到PVDF膜上，通过切割含目的蛋白条带测序。
致谢:该研究工作获得昆明龙津药业公司资助,在此表示感谢!
【参考文献】
[1] CHEN Y L,TSAI J H. Functional and sequence characterization of agkicetin,a new glycoprotein Ib antagonist isolated from Agkistrodon acutus venom [J]. Biochem Biophys Res Commun,1995， 210 (2): 472-477.
[2] YEH C H,PENG H C,YIH J B，et al. A new short chain RGDcontaining disintegrin,accutin,inhibits the common pathway of human platelet aggregation [J]. Biochim Biophys Acta ，1998，1425 (3): 493-504.
[3] HUANG Q Q,TENG M K,NIU L W. Purification and characterization of two fibrinogenclotting enzymes from fivepace snake (Agkistrodon acutus) venom [J]. Toxicon， 1999，37(7): 999-1013.
[4] CHENG X,XU ZY,LIU QD， et al. Purification and characterization of a platelet agglutinating inhibiting protein (agkisacutacin) from agkistrodon acutus venom [J]. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao,2000，32(6):653-656.
[5] PAN H,Du X,YANG G， et al. cDNA cloning and expression of acutin.[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1999,255(2):412-415
[6] XU X L,LIU Q L. Purification and characterization of a novel anticoagulation factor (ACF Ⅱ) from the venom of Agkistrodon acutus [J]. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao, 2000;32(1):84-86.
[7] YEH C H,CHANG M C,PENG H C， et al. Pharmacological characterization and antithrombotic effect of agkistin,a platelet glycoprotein Ib antagonist [J]. Br J Pharmacol,2001， 132(4):843-850.
[8] IANG XX,CHEN J S,ZHOU Y N,et al. Purification and biochemical characterization of FⅡa,a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutus venom [J]. Toxicon,2001,39: 1133-1139.
[9] 郑颖，向左云，姚光宁，等. 尖吻蝮蛇毒中精氨酸脂酶的分离纯化与性质研究 [J]. 蛇志,2003,15 (1):3-5.
[10] 李婷，朱正光，余传林，等. 抗凝组分Acoagulatin的纯化鉴定及其抗凝特性 [J]. 第一军医大学学报， 2004， 24 (7): 836-838.
[11] 吴忠. 止血一类新药Halase的药效学研究[J]. 中药材,2005,28 (2)：125-138.
[12] 吴忠.止血一类新药Halase的一般药理学研究[J]. 中药材,2005,28 (4)：326-327.
[13] 苏薇薇. 止血一类新药Halase的长期毒性试验[J]. 中药材,2005,28 (3)：211-212.