溶解肠杆菌YH16 抗汞操纵子的克隆与分析
【摘要】 目的 通过对从污染地区分离出的抗汞菌株——溶解肠杆菌YH16的研究，获得新的抗汞操纵子基因，为汞污染环境的微生物修复打下基础。方法 通过质粒消除实验确定抗汞基因的位置，通过构建基因文库的方式筛选获得新的抗汞操纵子基因(mer)。结果 YH16的抗汞操纵子位于质粒上，该操纵子长达6 048 bp，由7个ORF组成，依次为merT、merP、merC、merA、merD、tnpA、tnpA，与典型的Tn501mer操纵子和Tn21 mer操纵子相比，缺少merR。结论 获得了缺少merR基因的mer操纵子，具有理论研究意义，并为抗汞工程菌的构建打下基础。
【关键词】 抗汞质粒;质粒敲除;mer操纵子;汞污染
)Abstract:Objective In order to obtain the Hgresistance operon,the gene library of mercuryresistance strain: Enterobacter dissolvens sp. YH16 was constructed. Methods Plasmidknockout experiment had been used to posit the Hgresistance gene,the gene library and bioinformatics analyzing tools had been used to screen the Hgresistance gene. Results The mer genes were posited in the plasmid and organized as merT，merP，merC，merA，merD，tnpA，tnpA,closely related to that located in Tn501 and Tn21,but lacking merR.Conclusion A different mer operon gene was obtained,which might lay a basis for the further study on the structure analysis and gene clone of it.
Key words:Hgresistance plasmid; plasmidknockout; mer operon; Hg pollution
随着工农业生产的发展和人类活动的不断加剧，环境中汞污染物的排放量与日俱增。环境中的汞可被转化为毒性很强的甲基汞，有可能通过食物链富集并进入人体，对神经、免疫、生殖系统等造成功能上的损害，从而威胁人类健康[1]。自然界存在的抗汞细菌是平时解决环境中汞污染的主角，它们可以将环境中的有机汞降解为无机汞，并进一步还原为毒性低、易挥发的金属汞[2]。目前已经公认微生物对汞及其化合物的抗性通常是由细胞内质粒或跳动基因上复杂转座子中的抗汞性操纵子(mer 操纵子)决定的[3]。
在以往的研究中，通过连续富集培养与驯化的方式，获得了一株具有高抗汞活性的菌株Enterobacter dissolvens sp. YH16，其对HgCl2的24 h汞去除率达70%[4]。进一步研究发现，YH16的mer操纵子位于其质粒上，通过构建YH16菌株质粒基因文库，获得了mer操纵子基因，为降解汞生物工程菌的构建奠定了基础，对解决环境中的汞污染问题具有重要的应用意义。
1 材料与方法
1.1 培养基
LB培养基与LA培养基按照分子克隆手册配制[5]。
1.2 菌株
大肠杆菌XL1Blue [hsdR17,supE44,recA1,endA1,gyrA46,thi1,relA1,lac/F]由本实验室保存。抗汞菌株Enterobacter dissolvens sp. YH16由本实验室从汞污染土壤中分离获得。pBluescript sk(-) 质粒购自TaKaRa公司。
1.3 酶和试剂
各种限制性内切酶、DNA marker、XGal、IPTG购自TaKaRa公司，T4连接酶、去磷酸化酶购自MBI公司。其他生物化学试剂均为国产分析纯。
1.4 菌株Enterobacter dissolvens sp. YH16的质粒消除
用EB对YH16的质粒进行消除，处理浓度与温度时间分别为20 mg/L，45 ℃，24 h;20 mg/L，30℃，24 h;10 mg/L，45 ℃，24 h。将处理后的培养液稀释并涂LB平板，30℃培养过夜后影印到含HgCl2 20 mg/L 的LB平板上，30 ℃培养24 h观察结果，分别挑取抗汞活性丢失菌株与未丢失抗菌活性菌株以碱裂解法小量提取质粒DNA，电泳检测。
1.5 抗汞质粒的转化
Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒的提取，XL1感受态的制备与转化参照分子克隆手册进行[5]。选择培养基为含有HgCl2 20 mg/L的LB培养基。
1.6 抗汞质粒基因文库的构建
参照分子克隆手册提取Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒和pBluescript sk(-)质粒[5]。YH16质粒DNA首先经HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ小量不完全酶切后电泳，选取最佳内切酶HindⅢ。再经HindⅢ大量不完全酶切后电泳，按照3 s DNA Gel Purification kit试剂盒说明书割胶回收6～10 kb片断。pBluescript sk(-)经HindⅢ 酶切后去磷酸化后并电泳，割胶回收。将酶切并回收的DNA片断与去磷酸化的克隆载体按5∶1的比例16 ℃连接过夜，转入大肠杆菌XL1，并涂布LA平板，进行蓝白斑筛选。
1.7 目标亚克隆的筛选
挑取白色转化子至LB液体培养基中，37 ℃摇床培养10 h左右后(A600控制在1.5左右)，以1 %的量接入含HgCl2 20 mg/L的LB液体培养基中，30 ℃、160 r/min培养1 d，分批处理样品，再用原子吸收光谱测量LB中的汞[4,6]。同时提取质粒酶切验证。
1.8 亚克隆测序与分析
测序由上海博亚生物公司完成。对插入片断通过ORF Finder (open reading frame finder) (http://ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf)寻找读码框，并采用BLASTn (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/cgi?)进行同源性分析。