叶酸偶联5氟尿嘧啶白蛋白对肿瘤细胞的毒性及靶向性研究
3 讨 论
研究发现,外源性的叶酸药物复合物与细胞膜表面的叶酸受体特异性结合叶酸药物/叶酸受体复合物周围形成凹陷,在细胞内形成内涵体,在核内体膜质子泵的作用下,内涵体内pH下降,使叶酸-药物/叶酸受体复合物的构象改变,药物从复合物上解离,药物被释到细胞内,而叶酸受体可再回到细胞膜表面,循环转运药物[13]。
实验数据处理时用阴性对照减去空白对照的值作为对照的,所有组别吸收值都减去空白值再进行抑制率的计算,阴性对照组是真正的对照组,是加有细胞的;空白对照是不加细胞的,是由于培养基及MTT本身所引起的吸收值,不是由于MTT被细胞还原引起的,故应减去空白值,再进行抑制率的计算。细胞靶向性实验结果发现，无叶酸的对照跟加有叶酸的对照没什么差别,说明叶酸本身对细胞生长没什么影响。为了保持实验的可比性和可靠性,选用了有加叶酸的阴性对照组减去空白组的值作为对照计算抑制率。
体外细胞毒性实验结果表明,叶酸偶联物5FUBF对宫颈癌FR(+)HeLa细胞有靶向作用,可经叶酸受体靶向到叶酸受体阳性FR(+)HeLa细胞,故显示出比原料药5FU更强的细胞毒性,这是因为叶酸偶联物和叶酸受体的结合具有特异性、选择性、亲合力强的特点,通过受体介导作用,增加药物FR(+)HeLa细胞浓度，可提高疗效,降低毒副作用,达到靶向作用。5FUB无偶联叶酸对FR(+)HeLa细胞的毒性较弱,且由于分子量增大，不利于其穿透细胞膜进入细胞内部,只能经内吞作用进入肿瘤细胞,故作用不及原料药5FU;而FR(-)A549细胞为叶酸受体阴性细胞,故叶酸偶联物5FUBF不能经叶酸受体介导靶向到FR(-)A549细胞内,与5FUB一样只能经内吞作用进入细胞内,故毒性很弱,都不及原料药5FU的细胞毒性强。
体外细胞靶向性验证实验中,5FU、5FUB对FR(+)HeLa细胞和FR(-)A549细胞的细胞毒性均不受游离的叶酸所影响,前者是因为药物无偶联叶酸,后者是因为FR(-)A549细胞为叶酸受体阴性细胞,5FUBF只能经内吞作用进入细胞内,故对游离叶酸不敏感;在FR(+)HeLa细胞中,先加入外源性叶酸进行抑制后,FR(+)HeLa肿瘤细胞膜表面的叶酸受体被过量的叶酸阻断,叶酸偶联物5FUBF无法经叶酸受体介导到宫颈癌FR(+)HeLa细胞,只能通过内吞作用进肿瘤细胞内,故叶酸偶联物5FUBF对FR(+)HeLa的细胞毒性随着游离叶酸的浓度不断增大而显著降低。这间接证实了叶酸偶联5FUBF可通过FR(+)HeLa细胞膜表面的叶酸受体介导进入细胞。
在实验中,换用无叶酸RPMI 1640培养液基于以下两点理由：(1)普通RPMI 1640培养液中含有的叶酸量是体内正常血浆中的1 000倍，而高浓度的叶酸可竞争抑制细胞对叶酸偶联物的摄取,从而影响到实验结果。(2)无叶酸RPMI 1640完全培养液中含有的10%小牛血清是细胞所需叶酸的唯一来源,以保证细胞在生理状态的培养液中生长[12]。
本实验探讨了叶酸偶联的5氟尿嘧啶蛋白体外肿瘤细胞毒性和靶向性,证实了叶酸偶联白蛋白可经叶酸受体介导途径靶向富集于叶酸受体丰富的肿瘤细胞,为进一步研究及进行体内动物靶向性研究提供参考。
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