PNPTK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究
3 结 果
3.1 重组载体的鉴定
酶切、PCR及测序鉴定表明PNPTK片段已正确插入pcDNA3.0中。
3.2 RTPCR检测目的基因的表达
图2结果显示，融合基因PNPTK在HepG2细胞中能够表达。
3.3 Western Blot检测目的基因表达
蛋白印记分析在分子量约66 kD处获特异性条带，大小与PNPTK基因产物相吻合，证明融合基因PNPTK能够在HepG2细胞内表达(图3)。
3.4 细胞生长曲线
从结果可以看出，添加前体药物之前，两种细胞生长曲线相似(图4)。
3.5 各细胞对MePdR的敏感性
HepG2对MePdR不敏感，IC50>200 μmol/L。HepG2/PNPTK的IC50≈7 μmol/L;当MePdR达100 μmol/L后可杀伤绝大多数细胞(图5)。
3.6 各细胞对GCV的敏感性
HepG2对GCV不敏感，IC50>1 000 μmol/L。HepG2/ PNPTK对GCV高度敏感，IC50=0.07 μmol/L(图6)。
3.7 旁观者效应
不论是一种前药单独作用或两种前药联合作用于HepG2细胞，对HepG2组的细胞存活率均无明显影响。在7 μmol/L MePdR单独作用下，HepG2/PNPTK组混合细胞的存活率约为48%。但在7 μmol/L MePdR和0.07 μmol/LGCV联合作用下，其存活率仅17%(图7)。
4 讨 论
在肿瘤自杀基因研究中，单自杀基因系统治疗肿瘤已经被广泛应用。单自杀基因系统治疗肿瘤存在着一些难以克服的弱点。首先，单自杀基因治疗的肿瘤复发后，很大一部分细胞对相应前药产生耐药性[8]。其次，不同肿瘤对不同系统敏感性不同，介导的旁观者效应也各不相同[9]。某个系统常仅对特定类型肿瘤有较好疗效。因此，人们希望通过发展融合自杀基因技术来克服这些缺点。所谓融合自杀基因就是利用基因工程技术将两种或多种自杀基因连接在一起而构建的融合基因，兼具两个单自杀基因的功能，有效克服了单基因系统的弱点[10]。Rogulski 等[11] 将TK 基因和CD 基因一起整合到逆转录病毒的RNA 链上,然后用逆转录病毒转导神经胶质瘤细胞,分别给予GCV和5FC,实验结果表明CDTK 基因系统联合治疗的疗效是单独放疗的100倍,也比单自杀基因系统和放疗联合治疗的效果提高20～40倍。
PNP/MePdR系统在迄今所有自杀基因系统中有着最强的杀瘤效应和旁杀伤效应。而MePdR/GCV系统则是目前应用最为广泛的自杀基因系统之一，并已在肝癌基因治疗中取得了一定的成果。本实验中，我利用这两个系统构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.0/PNPTK，希望能将二者的优势结合起来，提高对肝癌细胞的杀伤效率。从结果来看，达到了预期目的。
在PNPTK基因中，MePdR基因可将前药GCV转化为其单磷酸盐形式，进而被细胞内激酶转化为其二、三磷酸衍生物。这些三磷酸衍生物在细胞内的积聚并掺入初生的DNA链中抑制了DNA聚合酶的活性并最终导致细胞死亡[12]，其旁观者效应是由缝隙连接介导的[13]。而PNP/MePdR系统则能从复制、转录、翻译等多个环节杀伤肝癌细胞，且不论对分裂期还是静止期的肝癌细胞都具有杀伤作用。它的毒性产物是膜透性物质，可以穿过细胞膜持续杀伤周围细胞，其旁观者效应的发挥不需要缝隙连接[14]。鉴于两个基因引起旁观者效应的机理完全不同，因此该融合基因有望充分发挥两个系统的优势，对肝癌细胞产生良好的杀伤效应。融合基因中PNPK基因终止密码子和MePdR基因起始密码子通过重组PCR定点诱变[15]加以剔除，这保证了两个基因在同一个阅读框内。从测序结果看：序列全长中无终止密码子，能翻译成为连续氨基酸;目的序列唯一的碱基突变虽然使编码产物第483位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸，不过鉴于二者均属于极性、中性氨基酸，应该不会对蛋白质的空间结构产生明显影响;从RTPCR和Western Blot产物的电泳结果来看，融合基因在HepG2细胞中顺利实现了表达。
实验结果显示，在一种前药MePdR单独作用时，HepG2/PNPTK组混合细胞约50%被杀伤。在MePdR和GCV联合作用时，HepG2/PNPTK组所致旁观者效应较仅有MePdR单独作用时大大提高，有超过80%的混合细胞被杀伤，细胞存活率只有MePdR单独作用时的1/3左右，显示融合基因在不同前药联合作用下所致的旁观者效应较只给予其一种前药时明显提高。这说明PNP和TK两个基因的融合确实能使两系统的杀瘤机制互为补充，充分发挥两系统各自的优势。不过融合基因对肝癌细胞杀伤效应强大的优势需要在相应前药的协同作用下才能被充分发挥。另外，在前药联合应用时，每一种前药只需相对较小剂量就可以达到单自杀基因系统施加较大剂量单一前药所获得的疗效[16]。在体内治疗中，这有助于减少化疗药物的使用剂量，降低副作用。
本研究在细胞水平上证实了两种融合自杀基因载体对肝癌细胞的杀伤作用，为二者未来应用于肝癌乃至于其他肿瘤的体内治疗作了良好的铺垫。
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