诃子提取物及含药血清对大鼠肝细胞损伤保护作用的研究
2.5 MTT法检测诃子提取物及含药血清对CCl4诱导肝细胞损伤保护作用取贴壁生长的肝细胞，设空白组、CCl4模型组、诃子提取均设置4个剂量组(0.4，0.6，0.8，1mg/L);另外设置4个诃子提取物含药血清组，使血清终体积为20%，每组设8个复孔。各组在加入CCl4培养1 h后，分别加入待测药物继续培养6h，在光镜下进行细胞形态学检查，同时每孔加MTT 10 μl，孵育4h，弃去上清，每孔加DMSO 150 μl，振摇10 min，在570 nm处用酶标仪检测吸光度。
2.6 GOT、MDA、SOD和GSH-Px的检测收集各孔中的细胞，参照试剂盒说明书检测GOT、SOD和GSH-Px以及MDA含量。
3 结果
3.1 光镜下观察诃子提取物对于CCl4所诱导损失的保护作用在光镜下观察发现CCl4损伤1h后，肝细胞形态发生显著的变化，镜下可以看到细胞的膜结构被破坏，大量肿胀坏死细胞。而诃子提取物以及含药血清组中对于这种形态改变具有显著的改善作用。
3.2 诃子提取物以及含药血清对CCl4诱导肝细胞损伤后细胞活力的影响诃子提取各浓度组(0.4，0.6，0.8，1 mg/L)分别作用于肝细胞损伤6h后，由MTT结果可以看出，诃子提取物0.6，0.8，1 mg/L组中与CCl4模型组比较具有明显的保护作用(P<0.01)，而且这种保护作用具有一定的量效关系。见表1将不同剂量制备的诃子含药血清与肝细胞作用6h后，对于CCl4所致的肝损伤具有一定保护作用，在各剂量组中只有在0.9 g/kg具有显著的保肝作用(P<0.05)，其他各剂量组的肝脏保护作用并不显著，结果见表1。
3.3 诃子提取物以及含药血清对GOT的影响诃子提取物对于CCl4所致的GOT渗出率有很好的抑制作用，可以显著降低GOT的活性，在0.6,0.8,1mg/L 剂量时对CCl4引起的肝细胞损伤具有显著的保护作用(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。在诃子含药血清各组别中，0.9 g/kg时具有显著的作用，显著降低GOT的渗出(P<0.05)。结果见表2表1 诃子提取物及含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤MTT的结果表2 诃子提取物及含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤GOT的影响
3.4 诃子提取物及含药血清对肝细胞MDA的影响CCl4损伤后可以导致显著的脂质过氧化反应，使脂质过氧化产物MDA显著升高，诃子提取物在0.6，0.8，1 mg/L时能够显著抑制CCl4所致的MDA升高(P<0.05或P<0.01)，具有显著的抑制脂质过氧化作用。见表3诃子含药血清对于异常升高的MDA具有显著的抑制作用，在剂量组0.6，0.9 g/kg时均具有显著的作用(P<0.05)。见表3。
3.5 诃子提取物及含药血清对SOD及GSH-Px的影响SOD和GSH-Px是体内重要的抗脂质过氧化酶类，诃子提取物0.6，0.8，1 mg/L能够显著的提高SOD的活性(P<0.05或0.01)，并具有一定的量效关系。对于GSH-Px的活性影响不显著，诃子提取物仅在1mg/L时能够显著的提高GSH-Px酶活性(P<0.05)，而在0.4mg/L时具有显著的降低GSH-Px活性的作用(P<0.01)，可能实验误差等原因所致。见表4。表3 诃子提取物及含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤MDA的影响表4 诃子提取物对CCl4所致大鼠肝细胞损伤SOD、GSH-Px的影响诃子提取物含药血清在0.3，0.6，0.9 g/kg时能够显著的提高SOD的活性(P<0.05或P<0.01)，同时具有一定的量效关系。诃子提取物含药血清对于GSH-Px活性的影响，在0.6 g/L和0.9 g/L均可以显著的提高GSH-Px酶活性(P<0.05)，而0.06 g/L时则显著的降低酶活性，可能与实验误差有关。结果见表5。
4 讨论
诃子是在中蒙药中经常使用的一味药，具有多方面的药理作用。实验中采用CCl4诱导肝细胞损伤的方法，CCl4 是经典的致急性肝中毒试剂。目前，一致认为自由基的形成及引发的链式过氧化反应是其中毒作用的主要机制。CCl4 在肝细胞内，在细胞色素P-450作用下，产生O 2-·、C C l 3- ·、C C l 3OO-·、·OH 等自由基和H2O2，诱导细胞膜发生脂质过氧化反应，并引发一连串的自由基链反应，从而破坏生物膜结构的完整性，引起膜通透性增高，导致胞内相关酶外释，细胞内氧化还原的平衡状态被打破，最终导致细胞死亡[10]。实验中通过镜检以及MTT法发现诃子提取物以及含药血清对于CCl4诱导的细胞的死亡具有很好的抑制作用，能显著的提高细胞活力。表5 诃子提取物含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤SOD、GSH-Px的影响 MDA 是细胞膜脂质过氧化反应的终产物，细胞中MDA 含量多少可反映细胞脂质过氧化损伤程度;SOD和GSH 是细胞内源性重要的抗氧化剂，其含量多少是衡量细胞抗氧化能力大小的重要指标。因此，MDA 生成量与SOD和GSH 含量水平两个指标可直接反映细胞脂质过氧化反应程度。在诃子提取物及含药血清均可以降低MDA的含量并提高SOD和GSH 的活性，以上均提示了诃子的保肝作用与抗脂质过氧化作用有关。
总之，我们通过体外实验发现诃子的保肝作用与提高抗脂质过氧化作用有关，血清药理学被用于诃子保肝作用的研究中。但是，通过对比发现，可能由于诃子保肝有效成分含量低或在体内生物利用度比较低，导致了诃子提取物含药血清保肝作用并不是很理想。而这些正是下一阶段研究方向，通过本实验中建立成熟的体外肝细胞损伤模型，为筛选诃子保肝作用活性单体并完善相应分子机理奠定基础。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中国药典, Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2000：146.
[2] 中国医学科学院药物研究所.中药志，第3册[M].北京：人民卫生出版社，1984：424.
[3] 丁 岗，刘延泽.诃子中的多元酚酸类成分[J].中国药科大学学报, 2001，32(3):193.
[4] 张海龙，裴月湖，华会明.诃子化学成分及药理活性的研究进展[J].沈阳药科大学学报, 2001，18(6):453.
[5] Yoskiki K. Antitumor agents，1291 tannins and related compounds as selective cytotoxic agents[J].J Nat Prod, 1992. 55(8):1033.
[6] Nonaka G. Anti-aids agents; 2’: inhibitory effects of tannins on HIV reverstransoriptase and HIV replication in H9 lymphocyte cells[J]. J Nat Prod, 1990. 55(3):587.
[7] 张述禹，白喜翠，李春汇. 诃子醇提取物对实验动物肝功能的影响[J].中国民族医药杂志, 1997，10(4):41.
[8] 韩俭于，红 娟，吴勇杰, 等. 中药血清药理学方法学研究—抗菌试验含药血清处理方案的研究[J].中药药理与临床, 2002，18(2): 47.
[9] 徐叔云，卞如濂，陈 修, 等.药理学实验方法学，第3版[M].北京: 人民卫生出版社，2003：528.
[10] Aguilar-Delfin I，Lopez-Barrera F，He rnandez- Munoz R, Selective enhancement of lipid peroxidation in plasma membrane in two experimental models of liver regeneration: partial hepatectomy and acute CCl4 administration[J].Hepatology, 1996，24: 657.