氧耗剂致乳鼠心肌缺氧/复氧模型的建立
2.3.2 培养上清液中LDH水平采用试剂盒说明书操作，于酶标仪450 nm处测定其吸光度值。
2.4 统计学方法采用SPSS11.0 版统计软件，实验数据用± s表示，组间比较采用t检验。
3 结果
3.1 氧耗剂对心肌细胞形态的影响倒置显微镜下可见正常培养72 h的细胞单层规律性的同步搏动，搏动有力，搏动频率80 ~ 100 min-1。给予氧耗剂Na2S2O4后可见细胞搏动频率减慢，部分皱缩、漂浮、死亡，且当Na2S2O4浓度越高，作用时间越长时，坏死细胞越多。
3.2 不同浓度连二亚硫酸钠作用后心肌细胞存活率及LDH水平实验结果表明，Na2S2O4 可致心肌细胞存活率下降，尤其当Na2S2O4 浓度超过3 mmol/L时MTT测定细胞OD值与正常对照组有显著差异(P﹤0.01)。同时心肌细胞上清液中LDH释放量均高于正常组，呈浓度依耐性。表1 不同浓度 Na2S2O4 作用后心肌细胞存活率及LDH水平
3.3 Na2S2O4 不同作用时间心肌细胞存活率及 LDH 变化同一浓度下，Na2S2O4 与细胞作用时间越长，Na2S2O4 对细胞的损伤越显著，细胞存活率越低。Na2S2O4可使细胞MTT的OD值与正常对照组有显著差异。缺氧/复氧后心肌细胞上清液中LDH释放量均高于正常组，且呈时间依耐性。表2 Na2S2O4 不同作用时间心肌细胞存活率及LDH水平
4 讨论
在细胞水平上，常以乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模拟载体心肌缺血/再灌注损伤。心肌细胞缺氧/复氧后引起损伤的机制与氧自由基的释放、钙超载、细胞死亡和凋亡等有关[4]。Na2S2O4 作为一种氧清除剂，不仅不会损伤细胞膜[5]，且一般在给予适当剂量 2～10 min 即可清除培养基中的氧，造成心肌细胞缺氧[6];缺氧后换液，洗去 Na2S2O4 后即造成复氧[7]。然而国内对应用化学制剂制作心肌细胞缺氧模型的研究鲜有报道，为了更好地建立氧耗剂致心肌缺氧的模型，我们采用原代培养的心肌细胞建立了 Na2S2O4 缺氧复氧模型，旨在为心肌缺血再灌注机制的研究和药物筛选奠定基础。MTT 比色分析法是根据活细胞能选择性地将四甲基偶氮唑盐还原成蓝黑色的甲膳沉淀物的原理而建立的测定活细胞的方法，其操作简单，客观准确，能反映细胞与药物的关系，便于实验室开展。LDH 是反映心肌损害的主要生化指标，其可信度高，重复性好。心肌细胞损伤后LDH将释放在细胞外液[8]，细胞外液中LDH活性的高低一定程度上反映了Na2S2O4 对心肌细胞的损伤程度。结果显示，Na2S2O4可使心肌细胞存活率急剧下降，缺氧各实验组培养基中的 LDH 含量明显高于正常对照组，并随着氧耗剂浓度的增高和缺氧时间的延长而较正常对照组明显增高。综上所述，我们认为 Na2S2O4 构建的缺氧模型起效快、操作简单、便于控制且使用安全，是一种值得推广的方法。
【参考文献】
[1] 刘 慧,燕 炯,许言午，等.离体大鼠心肌局部缺血/再灌注模型制备方法的改良[J].中国药物与临床，2007,7(8):586.
[2] Ito T, Yoshimura M, Nakamura S. Inhibitory effect of natriuretic peptides on aldosterone synthase gene expression in cultured neonatal rat cardiocytes [J].Circulation，2003,107(6):807.
[3] D. L 斯佩克特，RD戈德曼，LA莱因万德著.细胞实验指南，上册[M].黄培堂译,北京：科技出版社，2001：79.
[4] Sun HY,Wang NP,Kerendi F, et al. Hypoxic postconditioning reduces cardiomyocyte loss by inhibiting ROS generation and intracellular Ca2+ overload[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288(4):H1900.
[5] 许蜀闽,王培勇,马红英.连二亚硫酸钠在建立培养细胞的无氧环境中的应用[J].第三军医大学学报，2005,27(4): 359.
[6] 潘志伟，王秋娟， 柳仁民，等.淫羊藿苷预适应对乳鼠心肌细胞的保护作用[J]. 中国药科大学学报，2007，38(1) ：73.
[7] Liu J, Kam KW,Zhou JJ,et al. Effects of heat shock protein 70 activation by metabolic inhibition preconditioning or kappa-opioid receptor stimulationon on Ca2+ homeostasis in rat ventricular myocytes subjected to ischemic insults[J].J Pharmacol Exp Ther，2004，310(2): 606.
[8] 段为钢，李惠兰，张荣平，等.复方褐毛甘西鼠尾对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 时珍国医国药，2007，18(3):621.