毛冬青酸性、酚性及皂苷类成分分离鉴定

　　3 结构鉴定

　　3.1 化合物1浅黄色片状或针状结晶，mp 155～156℃(毛细管封闭法),三氯化铁和2，4-二硝基苯肼反应阳性。IRνKBrmax (cm-1)：3210(缔合羟基、宽峰)，1650(羰基)，1 590、1 535、1 440(苯环)及870、810、750(苯环芳氢)。UVλ MeOHmax nm：205，231，280 ，312。MS：m/z 138(M+),137(M-1)，109(M-29),91,81,63,53。1H-NMR (500MHz,CD3OD)δ：6.85(1H,d,J=8Hz),7.24(2H,m ),9.63(1H,s)。13C-NMR (CD3OD,125MHz) δ：115.30，116.22，126.43，130.84，147.21，153.74(苯环)，193.07(醛基)。根据以上理化性质及光谱数据并与SADTLER标准光谱比较，鉴定为3，4-二羟基苯甲醛，即原儿茶醛。

　　3.2 化合物2白色结晶，mp 136～137℃;在薄层板上显有机酸反应;IRνKBrmax (cm-1)：3 500～2 300 (宽峰，缔合-OH)， 1 700(>C=O)，1 650(>C=C<)1 460，1 410，1 372，1 330，1 190，1 140，1 125，1 038，1 010，940，875，750，700。UVλMeOHmax nm：220。 MS m/z： 184(M+)，166(M-18),155(M-29)，142(M-42)，124，113，96，71，67，55。HRMS m/z：184.073 200 (计算值184.073559)，得分子式C9H12O4，不饱和度为4。根据1H-1H COSY、HMQC，对相关信号进行了归属，1H-NMR(500MHz ,CD3OD)δ 5.095(1H,br，d，H-4)，1.522(1H，m，H-5)，2.033(1H，m，H-5)，1.361(2H，m，H-6),0.902 (3H，t，J=7.5Hz，H-7) 、2.080(3H，s，H-8);13C-NMR(125MHz，CD3OD)δC175.17(C1)137.36(C2)，150.69(C3)，82.99(C4)，35.75(C5)，19.15 (C6)，14.10(C7)，10.66(C8)，164.79(C9)。以上理化性质及光谱数据与文献[1]中decumbic acid一致，故鉴定为 decumbic acid。

　　3.3 化合物3白色结晶，200℃以上升华。在薄层板上显有机酸反应。IR ν KBrmax (cm-1)：3 080(宽峰，缔合-OH),1 680 (-COOH)。UVλ MeOHmaxnm：211 。MS m/z： 116(M+)，98(M-18)，88(M-28)，81，72，53。1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ 6.697。 13C NMR(125MHz，CD3OD) δ135.185，168.036。 根据以上理化性质及光谱数据并与SADTLER标准光谱比较，鉴定为富马酸，即反式丁烯二酸。

　　3.4 化合物4浅黄色颗粒，IRνKBrmax(cm-1)：3 360(OH)，1 700(-COOH)， 1 595， 1 520(Ar)，1 442，1 350，1 270，1 150，1 030，970。UVλMeOH max nm：210，235，245，300，328。MS m/z： 539[M+Na]+， 517[M+1]，499。1H-NMR(500MHz ,CD3OD)δ：6.14、6.24(2×1H,d，J=16.0， C8′-H),6.68，6.69(2×1H,d，J=8.0, C5′- H)，6.85,6.86(2×1H,dd，J=8.0, J=2.0, C6′-H), 6.94, 6.96(2×1H,d， J=2.0, C2′-H),7.47,7.55(2×1H, d，J=16.0，C7′-H)，2.04(1H,dd，J=14.0，4.0，C6-H),2.16～2.20(2H,m，C2-H), 2.25(1H,dd，J=14.0，4.0，C6-H),4.31(1H,，dd,J=8.5，3.0，C5-H), 5.06(1H,dd,J=8.5，3.0，C4-H),5.55(1H,m， C3-H)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz),鸡纳酸部分δ:C1 75.95， C2(39.24或38.37)，C3(68.97)，C4( 69.22)，C5(75.60)，C6( 39.24)，176.73为C1上的 -COOH, 咖啡酸部分：C1 ′(123.16),C2′( 114.65)，C3′(149.70)，C4′(146.78)，C5′(115.12)， C6′(127.63)，C7′(147.73或147.61)， C8′(114.70或116.46)，C9′(168.55 或168.20)。以上数据与文献[2] 中3，4-二咖啡酰鸡纳酸一致，故鉴定为3，4-二咖啡酰鸡纳酸。

　　3.5 化合物5白色结晶，mp 191～193℃;在薄层板上显有机酸反应;IRνKBrmax (cm-1)：3 600～2 300(宽峰，缔合-OH)， 1 680(>C=O) ，1 410，1 300，1 195。根据以上理化性质及红外光谱数据，并与SADTLER标准光谱比较，鉴定为丁二酸，即琥珀酸。

　　3.6 化合物6无定形粉末，mp >300℃;可溶于甲醇、乙醇。IRνKBrmax (cm-1)：3 450(-OH), 2 931，1 690(>C=O)，1 647, (>C=C<)，1 455，1 384，1 252，1 157，1 044，769。UVλMeOHmax nm：205。FABMS m/z：525(M+Na)+，483(M-H-H2O)，438(M-HCOOH-H2O)。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δ：1.13(3H,s，Me)，1.16(3H,s.Me)，1.46(3H,s.Me)，1.71 (3H,s.Me)，1.76(3H,s.Me)，1.11(3H,d，J=6.4,Me),3.06(1H,s,H-18),3.35(1H, dd,J=11.6,4.3,H-3)，5.11(1H,br,s,19-OH,重水交换消失)，5.62(br,t,H-12)。13C-NMR (100MHz, C5D5N)见表1。以上数据及理化性质与文献[3]中ilexgenin A一致，故鉴定为ilexgenin A。

　　3.7 化合物7无色细小针晶，mp243～244℃;可溶于甲醇、乙醇。IRν KBrmax (cm-1)：3 436(-OH), 2 928，1 697(>C=O)，1 637, (>C=C<)，1 456，1 370，1 167，1 071，1 041，762。 FABMS m/z：789(M+Na)+， 455，437。1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ：0.88(3H,s，Me)，1.08(3H,s.Me)，1.09(3H,s.Me)，1.12(3H，d，J=7,Me)，1.25(3H,s,Me)，1.42(3H,s，Me),1.74(3H,s. Me),3.28(s,H-18),4.81(1H,d,J=7,Xyl-H-1)，5.05(s,19α-OH，重水交换消失)，5.35(1H,d,J=7.5,Glu-H-1)，5.54(1H,t, H-12)。 13C-NMR (100MHz,C5D5N)见表1。 以上数据及理化性质与文献[3]中ilexsaponin B1一致，故鉴定为毛冬青皂苷B1(ilexsaponin B1)。

　　3.8 化合物8白色无定形粉末，可溶于甲醇、乙醇。IRν KBrmax(cm-1)：3 436(-OH), 2 927，1 697(>C=O)，1 637, (>C=C<)，1 456，1 387，1 075，1 041，985，813，763。 FABMS m/z：935(M+Na)+;1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ：0.83(3H,s，Me)，1.06(3H,s.Me)，1.32(3H,s.Me)，1.41(3H,s，Me)，1.74(3H，s，Me)，1.11(3H,d,J=7.2,Me)，1.77(3H,d,J=6.4，rha-Me),3.3(1H,s,H-18),4.89(1H,d, J=5.4, Xyl-H-1)，5.04(1H,s,19α-OH，), 5.53 (1H,br，t, H-12)，5.80(1H,d,J=7.6,Glu-H-1),6.40(1H, br，s, rha-1-H)。13C-NMR (100MHz, C5D5N,)见表1。 以上数据及理化性质与文献[3]中ilexsaponin B2一致，故鉴定为毛冬青皂苷B2(ilexsaponin B2)。

　　3.9 化合物9白色无定形粉末，mp290～291℃;可溶于甲醇、乙醇。Liebermann- burcharde试验和α-萘酚试验均呈阳性，IRνKBrmax (cm-1)：3 400(-OH), 2 925，1 720(>C=O)，1 630,(>C=C<)，1 443，1 380，1 060，1 020，985，790，755。FABMS m/z：687(M+Na) +。酸水解检查出葡萄糖，苷元部分TLC与化合物6薄层色谱行为一致，根据以上数据及理化性质并与文献[3]比较，鉴定为毛冬青皂苷甲(ilexsaponin A1)。

　　3.10 化合物10白色细针状结晶，mp281～283℃;可溶于甲醇、乙醇、氯仿等。Liebermann- burcharde试验呈阳性，IRνKBrmax(cm-1)：3443(-OH), 2 933，1 692(>C=O)，1 649, (>C=C<),1452，1372 1278， 1 035，999。UVλ MeOHmax nm 234(ε7431)。EIMS m/z：454(M+)，436(M-H2O)，408(M-HCOOH)，390(95)(M -HCOOH，-H2O)，375，347，246，231，207，201，189，187，185(100)，145，119，55。1H-NMR(600MHz， CDCl3)δ：0.79(3H,s，Me)，0.90(3H,s.Me)，0.97(3H,s.Me)，0.99(6H,s，2×Me)，1.04(3H，d，J=6.6,Me-CH)，1.73(3H,s, Me-C=)，3.23(1H,dd,J=10.8,4.8,C3-H),5.41(1H,宽s,C12-H)。以上数据与文献 [4]中毛冬青苷甲的苷元数据基本一致，又根据DEPT碳谱数据，以乌索酸及其甲酯为基本母核对其碳信号进行归属，13C-NMR(600MHz，CDCl3)数据见表1。根据以上数据，鉴定(10)为毛冬青酸(ilexolic acid)，即(18-去氢-20-表-乌索酸)。经查文献，本品为首次从天然产物中获得，为了检测其在天然产物中的存在，取毛冬青根，加水煎煮，浓缩，乙醇沉淀，滤过，滤液挥去溶剂，残留物加少量水稀释，用醋酸乙酯萃取，回收溶剂后，残留物以甲醇溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，另取结晶10用甲醇制成每1 ml含约0.1 mg的溶液，作为对照品溶液，以乙腈∶甲醇∶水∶乙酸铵(70∶16∶14∶0.5)为流动相，以高效液相色谱法检测，检测波长234 nm，结果在供试品色谱中在与对照品相同的保留时间处检测到色谱峰。

　　3.11 化合物11无色针晶，mp 139～141 ℃;ESI/Ms测得M+Na峰437和M-H峰413，与已知品β-谷甾醇共薄层色谱，Rf值和色斑一致，IR与The acdrich library infrared spectra中β-谷甾醇一致，故鉴定为β-谷甾醇。表1 化合物 6～8、10的13C-NMR数据

【参考文献】
  　[1] G.he，H.matsuura，T.yoshihara. Isolation of an α -methylene-γ -butyrolactone derivative,a toxin from the plant pathogen Lasiodiplodia theobromae [J].Phytochemistry 2004,65：2803.

　　[2] 秦文娟，吴秀娥，福山爱保，等.苦丁茶化学成分研究(Ⅱ) [J].中草药，1988，19：486.

　　[3] 冯 峰，朱明晓，谢 宁.毛冬青化学成分研究 [J]中国中药杂志，2008，43(10)：732.

　　[4] 蒋仲芳，黄柔湘，秦国伟，等 .毛冬青化学成分的研究　Ⅷ　四种三萜皂甙的分离和鉴定 [J].中草药，1991，22(7)：291.