五鹤续断18S rRNA基因序列的分析

　　4 讨论

　　五鹤续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperoides C.Y.cheng et T.M.Ai的干燥根，是常用中药。其产地以湖北省五峰县、鹤峰县为主，量大质优，故名“五鹤续断”。《湖北中药资源》载湖北续断为川续断科川续断，多为野生，少家种，主要分布的最佳适生地带为鄂西南山区的鹤峰、巴东、建始、利川、恩施、五峰、长阳等县市[13]。冯耀兰等编著的《中药材商品规格质量鉴别》一书，从续断历代的商品质量角度，较为详细的介绍了主产五峰、鹤峰两地续断的地道性及其优良的品质特征，书中载：川续断主产湖北巴东、长阳、宜昌、鹤峰、兴山、五峰、四川涪陵、湖南石门、桑植，以湖北产量大，质量优，尤以鹤峰质量最优[14]。在五鹤续断的原产地鹤峰，2001年被湖北省科技厅、省药监局确定为“湖北省续断药材规范化种植研究及示范建设基地”。这些都佐证五鹤续断为恩施州道地药材。为保证其道地性，有必要找到其特有的分子标记并制定其分子鉴定标准。而18S rRNA基因序列结构功能十分保守，进化速度较慢，若其序列存在变异就能成为一种很好的DNA标记，可用于鉴别中药品种[15]。

　　本实验所得五鹤续断18S rRNA基因序列与亲缘关系较近的Dipsacus sp. Jansen 931比对，发现有三个位点变异，即在第6个位点缺失，第1075(G-K)和1290(G-N)位点发生置换，其余的完全相同，同源性为99%。说明18S rRNA基因的序列长度保守，该基因在续断科内的差异很小，反映了种内的遗传稳定性，说明五鹤续断的18S rRNA基因序列保持了高度的同源性，但又有少量稳定的种内差异性，是十分保守的序列，可以此确定作为该物种的基源。

　　为获得准确可靠的实验结果，我们分3次对同一株五鹤续断叶片的总DNA进行提取，每次提取3支，每支提取的DNA都做2次PCR扩增，并在DNA提取和PCR扩增过程中都做了阴性对照实验，最终每个基因选取3个良好的扩增产物用于测序，所获得结果相同，证明了本实验结果的准确性和可靠性。

　　我们首次成功克隆测序出五鹤续断18S rRNA基因，并对其基因序列结构进行了初步分析。这一研究为从分子水平上探究五鹤续断这一物种系统进化关系以及物种分析鉴定等提供了一些基础性资料。

　　研究表明，18S rRNA基因可作为五鹤续断的理想分子标记，通过测序、同源性比较，能了解其基因结构组成特点，而且DNA测序稳定性强，重复性好，结果准确可靠，可作为五鹤续断鉴定的依据，也为下一步了解五鹤续断的分子系统发育关系提供基础性资料，还可克服某些情况下形态学鉴定和理化鉴定的误差，进行准确的分子鉴定。

【参考文献】
  　[1] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(下册)[M].北京：人民卫生出版社，2000：135.

　　[2] 李今庸.湖北医学史稿[M].武汉：湖北科学技术出版社，1993：258.

　　[3] 纪顺心，吴雪琴，李崇芳.中药续断对大鼠实验性骨损伤愈合作用的观察[J].中草药，1997，28(2)： 98.

　　[4] 龚晓键，季 晖，王 青，等.川续断总生物碱对妊娠大鼠子宫的抗致痉及抗流产作用[J].中国药科大学学报，1997，29(5)：459.

　　[5] 张文蘅，陈之端，陈虎彪，等.从叶绿体DNA trnL-F序列论双参属的归属问题[J].植物分类学报，2001，39(4)：337.

　　[6] Fushimi H，Komatsu K，Isobe M，et a1.Application of PCR-RFLP and MASA analysis on 18s ribosomal RNA gene sequence for identification of three Ginseng drugs[J].Biol Pharm Bull，1997，20(7)：765.

　　[7] 曹 晖，刘玉萍，伏见裕利，等.三七及其伪品的DNA测序鉴别[J].中药材，2001，24(6)：398.

　　[8] 刘玉萍，何报作，曹 晖.基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅱ)-山药基原的DNA测序鉴别[J].中草药，2001，32(11)：1026.

　　[9] Yang Dong-Ye，Fushimi Hirotoshi，Cai Shao-qing，et a1.Molecular analysis of Rheum species used as Rhei Rhizoma based on the chloroplast matK gene and its application for identification[J].Biol Pharm Bull，2004，27(3)：375.

　　[10] Cao Hui，Sasaki Yohei，Fushimi Hirotoshi，et a1.Molecular analysis of medicinally-used Chinese and Japanese Curcuma based on 1 8S RNA gene and trnK gene sequences[J].Biol Pharm Bull，2001，24(12)：1389.

　　[11] Doyle J J.Doyle J L.A rapid method isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemistry Bulletin，1987，19：11.

　　[12] Sogin M L.Amplification of ribosomal RNA gene for molecular evolution studies[M]∥Innis M A，Gelfand DH，Sninsky J J.PCR Protocols.San Diego：Academic Press，1990：307.

　　[13] 刘国杜.湖北中药资源[M].北京：中国医药科技出版社，1989：226.

　　[14] 冯耀南.中药材商品规格质量鉴别[M].广州：暨南大学出版社，1995：181.

　　[15] 陈随清，王利丽.rRNA基因(rDNA)序列分析在中药品种鉴定中的应用及研究进展[J].河南中医学院学报，2003，18(2)：86.