青钱柳种子无菌萌发研究
3 结果
3.1 浓硫酸酸蚀时间对青钱柳种子萌发的影响青钱柳不经酸蚀，种壳对种子的萌发产生了很大的阻力，发芽率为0(结果见表1)。用浓硫酸进行不同时间的酸蚀后，酸蚀4.5 ，9.5 h两个处理中均有种子发芽，以9.5 h的发芽率最高，说明在一定范围内，随酸蚀时间的延长，种子的发芽率升高，但酸蚀时间过长，酸蚀13.5 h，会导致种子胚的损坏，最终导致种子无法萌发。表1 浓硫酸对青钱柳种子萌发的影响
3.2 不同浓度GA3、浸种时间和浸种温度对青钱柳种子萌发的影响不同浓度的GA3浸种可显著促进种子萌发，有效解除种子休眠[5]。正交实验结果表明，综合处理可促进种子萌发，但发芽时间和发芽率有差异，A8处理的青钱柳种子发芽时间最早，17 d就可以看到种子发芽，60 d时发芽率可达42.11%， A9处理发芽时间最迟，1个月才发芽，且发芽率仅为10.53%(见表2)，说明A8处理能较快地打破青钱柳种子休眠和提高青钱柳的发芽率;极差分析表明，GA3浓度产生影响的极差最大，浸种温度的极差值最小，浸种时间次之，说明GA3的浓度对青钱柳种子发芽率影响最大，温度对青钱柳种子的发芽率影响最小，优化组合为GA3 1000mg/L+浸种24 h+浸种温度35℃。
3.3 不同激素种类及浓度对青钱柳种子萌发的影响不同的外源激素及其不同处理浓度对种子发芽势有明显影响[6]，本试验通过正交设计探讨不同激素组合对青钱柳种子萌发的影响，结果表明，B6处理种壳出现裂缝及发芽时间最早(15d)，发芽率最高，可达66.67%，B7和B9发芽率次之(36.84%);发芽数率最低的为B2，发芽率仅为10.53%(见表3)。极差分析表明，6-BA产生的影响极差最大，其次是NAA和GA3，说明三者对青钱柳种子萌发影响的大小依次为：6-BA﹥NAA﹥GA3，比较均值可得青钱柳种子萌发的最优培养基配方是:MS+6-BA 0.5mg/L + NAA 0.1mg/L + GA3 30 mg/L。表2 GA3浓度、浸种时间和浸种温度对种子萌发的影响 表3 GA3浓度、浸种时间和浸种温度对种子萌发的影响
3.4 培养基状态对青钱柳幼苗继代的影响当青钱柳幼苗长至4cm高时，将根尖和萌发芽剪下(长度约为2 cm左右)，分别接入激素水平为6-BA 2.0mg/L+NAA0.1mg/L的固体培养基和液体培养基中，其生长情况见表4。在固体培养基中，所转接的根和芽在接种21 d后均发生褐变和死亡。在液体培养基中，所转接的根在培养7 d后，根基部即产生愈伤组织，并逐渐膨大，培养至21 d时愈伤组织变黄;芽转入增殖培养基后，生长良好，培养至14 d就长出两个侧芽，继续培养则形成丛生芽，说明同一激素配方，液体培养基更有利于青钱柳幼苗的继代培养。表4 培养基状态对青钱柳幼苗继代的影响
4 讨论
青钱柳是我国特有的、集药用、材用和观赏等多种价值于一身的单种属珍贵树种，其种子具有深休眠特性，一般播种后需隔年甚至2年后才萌发，研究表明，综合处理措施可以有效解除种子休眠，缩短发芽时间[7]，尚旭岚等[8]通过浓硫酸酸蚀再剥取离体胚进行培养，获得了一定数量的再生植株，为青钱柳的快速繁殖提供了一种新的方法，但该试验对于GA3的影响，仅考虑了其浓度，并未将浸种温度、时间的影响因素考虑在内;在培养基的设计方面，激素水平也只涉及GA3;此外，由于青钱柳种子较小且坚硬，剥取离体胚具有一定的难度，本试验通过酸蚀预处理，浓硫酸对种子进行预处理后，采用正交设计对影响其萌发的GA3浓度、浸种温度和浸种时间进行研究，再将消毒的种子直接接种于正交设计的不同激素组合的MS培养基中进行无菌培养，经比较分析得出适合青钱柳萌发的最佳处理为：浓硫酸酸蚀9.5h+1000mg/L的GA3溶液+浸种24h+浸种温度35℃;种子萌发的最优激素组合为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+ GA3 30mg/L。
本试验对种子进行酸蚀和综合处理后直接进行无菌培养，不仅减少了剥离种胚的操作步骤，而且与传统的通过沙子层积打破种子休眠获得种苗相比，可直接得到无菌苗进行快速繁殖，为进一步探讨青钱柳种苗的规模化生产奠定了基础。
【参考文献】
[1] 谢明勇，李 磊.青钱柳化学成分和生物活性研究概况[J].中草药，2001，32(4)：365.
[2] 方升佐，杨万霞.青钱柳的开发利用与资源培育[J].林业科技开发，2003，17(1)：49.
[3] 杨万霞，洑香香，方升佐，等. 青钱柳种子的种皮构造及其对透水性的影响[J]. 南京林业大学学报(自然科学版)，2005，29(5):25.
[4] 史晓华，徐本美，黎念林，等.青钱柳种子休眠与萌发的研究[J].种子，2002，5:5.
[5] 刘自刚.外源激素破除桔梗种子休眠的方法研究[J]. 安徽农业科学，2008，36(20)：8458.
[6] 潘学军，张文娥，樊卫国，等.外源激素处理对贵州毛葡萄种子发芽的影响[J].种子，2007，26(1)：25.
[7] Shengzuo Fang ， Jiayuan Wang， Zhaoyang Wei， et al. Methods to break seed dormancy in Cyclocarya paliurus (Batal) Iljinskaja [J]. Scientia Horticulturae， 2006， 110:305.
[8] 尚旭岚，徐锡增，方升佐.青钱柳离体胚的培养及快速繁殖[J].南京林业大学学报(自然科学版)，2007，31(1)：101.