枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量的毛细管电泳高频电导法测定

【摘要】  目的建立枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法。方法采用毛细管区带电泳，高频电导检测;未涂层弹性融硅石英毛细管柱55 cm×75 μm ID，有效长度46 cm;1.2 mmol·L-1三乙胺-HCl(pH=10.60)，0.24 mmol·L-1β-环糊精为运行缓冲液;分离电压12.5 kV;重力进样10 s(高度20 cm)。结果以布洛芬为内标，齐墩果酸、熊果酸线性范围分别为5.1～102.0 g/ml(r=0.999 7)和5.55～111.0 g/ml(r=0.999 3);平均回收率分别为96.0%和97.2%。结论该法简便、准确、快速、重现性好，可用于枇杷叶的质量控制研究。

【关键词】  毛细管电泳; 高频电导检测; 枇杷叶; 齐墩果酸; 熊果酸

　　Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid isomers in Folium eriobotryae.

　　MethodsIt was studied by Capillary Zone Electrophoresis with high frequency conductivity detection. The separation was performed on a uncoated fused silica capillary of 55 cm×75 μm ID(46 cm effective length). 1.2 mmol·L-1 Triethylamine(TEA) buffer containing 0.24 mmol·L-1 β-cyclodextrin and pH adjusted to10.60 with Hydrochloric acid was selected for the running buffer. The voltage applied was 12.5 kV and temperature was maintained at 25℃. The sample was injected by gravity(10 s，20 cm).

　　ResultsThe linear ranges of determination for oleanolic acid and ursolic acid were 5.1～102.0 g/ml(r=0.9997) and 5.55～111.0 g/ml(r=0.999 3). The average recovery for oleanolic acid and ursolic acid was 96.0%,97.2% respectiviely.

　　ConclusionThe method is reliable，simple，rapid and accurate. The method can be used for quantitative determination of oleanolic acid and ursolic acid isomers in Folium eriobotryae.

　　Key words：Capillary Zone Electrophoresis; High frequency conductivity detection; Folium eriobotryae; Oleanolic acid; Ursolic acid

　　枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl. 的干燥叶，有清肺止咳、降逆止呕之功效，主治肺热咳嗽，气逆喘急，胃热呕逆，烦热口渴等症[1]，主产于广东、江苏、福建、江西等地。近年来对其化学成分的研究表明，其主要成分为三萜酸和倍半萜及其苷类，药理活性的报道也主要集中于三萜酸的抗炎、降血糖和抗病毒活性[2～4]方面。目前枇杷叶的含量测定方法有薄层色谱法[5]和HPLC法[6]。本文采用毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)高频电导(High frequency conductivity detection)检测的方法[7]，对不同产地枇杷叶中齐墩果酸(oleanolic acid，简称OA)和熊果酸(ursolic acid，简称UA)进行含量测定的研究，以期为药材质量控制提供可借鉴的依据。

　　1 仪器与试药

　　CES2003毛细管电泳仪，包括高压电源、高频电导检测器及毛细管电泳数据工作站(中山大学化学与化学工程学院研制)。ORION MODEL 828型pH计(美国)。DL-360超声波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂)，工作频率4.5 kHz ± 5%，输出功率240 W。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(75m ID，河北锐年永沣色谱器件有限公司)。

　　枇杷叶样品(批号1：购自广东清远;批号2：购自广东连山;批号3：购自河南;批号4：购自江苏;批号5：购自福建)，经广东药学院生药学专家房志坚副教授鉴定为真品。将其粉碎，于60℃下干燥4 h，置干燥器内备用。定量方法学考察采用广东清远的样品。

　　齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110709-200505);熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110742-200516);布洛芬对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100179-200303)。β-环糊精(中国医药集团上海化学试剂公司);三乙胺等试剂均为分析纯;水为去离子水(电阻为16.6MΩ·cm-1)。

　　2 方法

　　2.1 溶液的制备

　　2.1.1 内标溶液精密称取布洛芬对照品20.2 mg置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标贮备液(浓度为404 g/ml)。

　　2.1.2 对照品溶液 精密称取OA对照品20.4 mg，UA对照品22.2 mg置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(浓度分别为408 g/ml和444 g/ml)。

　　2.1.3 供试品溶液取本品粉末约2.0 g，精密称定，加甲醇40 ml，水浴中加热回流2 h，冷却至室温，转移至50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，续滤液0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

　　2.2 电泳条件未涂层弹性融硅石英毛细管柱50 cm×75 μm ID，有效长度46 cm;以1.2 mmol·L-1三乙胺-HCl(pH=10.60)，0.24 mmol·L-1 β-环糊精为运行缓冲液;分离电压12.5 kV;重力进样10 s(高度20 cm);温度25℃，湿度小于45%。毛细管柱在使用前依次用去离子水、0.1 mol·L-1的NaOH溶液、去离子水、缓冲液各冲洗5 min;检测电极和缓冲液容器用超声波清洗10 min。进样5次之后也需按照上述步骤清洗毛细管。在此条件下，对照品、样品色谱图见图1。1.齐墩果酸 2.熊果酸3.布洛芬 4.水峰图1 对照品(A)、样品(B)的毛细管电泳色谱图

　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 标准曲线制备 分别吸取一定量的对照品贮备液、内标溶液加甲醇稀释成含齐墩果酸浓度为5.1，10.2，20.4，40.8，61.2，81.6，102.0 g/ml、熊果酸浓度为5.55，11.1，22.2，44.4，66.6，88.8，111.0 g/ml与内标溶液浓度为20.1 g/ml的溶液。依次重力进样10s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，对照品溶液浓度(C)为横坐标进行线性回归，分别得回归方程YOA =0.023 5C-0.026 7(r=0.999 7);YUA=0.022 9C-0.026 4(r=0.999 3)。表明OA浓度在5.1～102.0 g/ml、UA浓度在5.55～111.0 g/ml范围内与峰面积线性关系良好。

　　2.3.2 精密度实验取浓度分别为40.8、44.4 g/ml的OA与UA对照品溶液，重力进样10 s，连续测定5次，记录峰面积并计算RSD。结果YOA的RSD =1.57%，YUA的RSD =1.35%，表明仪器精密度良好。

　　2.3.3 稳定性实验取供试品溶液(批号1)在0，2，4，8，24 h，分别重力进样10 s，记录峰面积。结果YOA的RSD = 4.64%，YUA的RSD =3.50%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

　　2.3.4 重复性实验取同一批号(批号1)样品6份，按“2.1.3”项下方法提取、测定。结果OA的平均含量为3.63 mg·g-1，RSD = 4.54%(n=6);UA的平均含量为9.08 mg·g-1，RSD = 3.88%(n = 6)。表明分析方法精密度良好。

　　2.3.5 加样回收实验精密称取同一批号(批号1)的枇杷叶药材共6份，加入相应量的OA和UA对照品，按“2.1.3”项下方法处理并测定，计算回收率。OA的平均回收率为96.0%、RSD =2.76%;UA的平均回收率为97.2%，RSD = 3.44%。结果表明方法准确、可靠。结果见表1～2。表1 OA回收率实验结果　表2 UA回收率实验结果

　　2.4 样品测定 取不同产地的枇杷叶，按“2.1.3”项下方法处理后测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。结果见表3。表3 枇杷叶样品中OA和UA的含量测定结果