枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量的毛细管电泳高频电导法测定
3 讨论
3.1 缓冲液的选择实验考察了NaAc-HAc，三乙胺-H3BO3，Tris-H3BO3，NaH2PO4-H3PO4，Tris-Na2HPO4，NaH2PO4- Na2HPO4， 三乙胺-HCl等几种电解质体系不同浓度和不同配比对分离效果的影响。结果发现，只有在三乙胺-HCl和三乙胺-H3BO3这两个体系中OA和UA可以出峰。将这两个体系进行实验对比，三乙胺-HCl体系基线平稳，峰形较好，检测信号灵敏度高，因此认为三乙胺-HCl体系是比较理想的缓冲液。
3.2 体系pH值的影响缓冲溶液的pH值是影响分离检测的一个重要因素，缓冲溶液的酸度直接影响毛细管表面的Zeta电势，从而影响电渗流(EOF)的方向和速率;同时溶液的酸度也决定样品中各组分分子的表观电荷数，继而影响组分的迁移时间和分离度。在比较不同pH值对分离效果的影响中发现，当pH值低于10.0时，峰形很差;在pH值于10.0～10.60之间，分离度逐渐加大;pH值为10.60时，OA和UA的峰形好，基线稳定，其原因可能是在此pH值条件下，OA和UA的羧基与三乙胺存在弱配合作用，形成的复合阴离子在电渗流作用下向负极移动，在流经检测器时电导值发生变化而被检测。
3.3 缓冲液浓度的选择三乙胺的浓度对分离产生很大的影响，在本实验中，保持pH=10.60及环糊精浓度为0.24 mmol·L-1不变的情况下，依次改变三乙胺的浓度(0～2 mmol·L-1)发现，随着浓度的增加，OA和UA的分离度及峰面积随之增加，但在浓度大于1.2 mmol·L-1时，分离度保持在1.5～2.0之间，并不会发生很大变化，而且此时电流增加，基线不平，迁移时间后移。因此在保证分离度的情况下，选择三乙胺的浓度为1.2 mmol·L-1，见图2。图2 三乙胺浓度对迁移时间的影响
3.4 添加剂的选择由于OA和UA属于构造异构体，空间结构中只有一个甲基的位置不同，在未加任何添加剂的情况下，检测时只有一个峰而无法实现分离。在保持体系不变，实验对SDS(十二烷基硫酸钠)、熊去氧胆酸、β-环糊精、HP-β-环糊精分别进行考察，发现SDS、熊去氧胆酸无法分离OA和UA，HP-β-环糊精分离效果不佳，β-环糊精能够对OA和UA产生较好的分离效果。
随后对β-环糊精浓度进行了实验考察，在0.02 ～0.6 mmol·L-1范围内，进样OA和UA混合对照品。当浓度低于0.24 mmol·L-1，标准品分离度达不到1.5;浓度在0.24～0.4 mmol·L-1，分离度又逐渐下降，且迁移时间延长;浓度大于0.6 mmol·L-1时，对照品无法分离，见图3。这是由于随着环糊精浓度的增加，相应增加了包结物的浓度，体系粘度增大，延长出峰时间;且浓度增加影响缓冲液的电渗流，溶液中各组分的电泳浓度也发生变化，从而影响分离度。经过对供试品和对照品的多次实验，选择β-环糊精浓度为0.24 mmol·L-1。图3 β-环糊精浓度对分离度的影响
3.5 电压、温度及湿度的影响随着电泳电压的增加(7～20kV)，样品出峰时间缩短，分离度变小，且电流显著增加，从焦耳热的影响和毛细管散热来考虑，选择12.5kV为最佳分离电压。见图4。实验中还发现，随着温度的改变及室内相对湿度的变化，对实验重现性有很大的影响，因此选择实验环境为25℃，相对湿度<45%为宜。图4 电压对迁移时间的影响
3.6 供试品提取方法的选择实验比较了甲醇、95%乙醇、乙醚、三氯甲烷4种提取溶剂，乙醚、三氯甲烷提取液的杂质较少，但提取率不高，甲醇与95%乙醇提取率相当，而甲醇提取液色谱图杂质峰少，对熊果酸与齐墩果酸测定无干扰,基线较平稳。选择甲醇作溶剂后，对比超声、索氏、加热回流3种提取方法，结果发现超声2 h和索氏提取的提取率均不如加热回流2 h的提取率，用加热回流的样品基线稳定，提取完全，OA和UA的检测状况良好。
4 结论
在优化的实验条件下，这几种药材中的OA和UA可以在6min之内得到很好的分离，并且进行含量测定，该高频电导检测器使用方便，灵敏度较高，实验重现性和精密度都比较理想。由于其自身的特点和优势，随着研究的深入，其应用潜力在毛细管电泳分离中草药成分中会得到更大的发挥。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：142.
[2] 葛金芳，李 俊，胡成穆，等.枇杷叶三萜酸的免疫调节作用研究 [J].中国药理学通报，2006，22(10)：1194.
[3] De Tommasi N,De simone F,Cirino G,et al.Hypoglycemic effect of sesquiterpene glycosides and polyhydroxylated trierpenoids of Eriobotrya japonica[J].Planta Med,1991,57(5):414.
[4] Shoko Tanigachi，Yoko Imayoshi，Eri Kobayashi，et al.Production of bioactive triterpenes by Eriobotrya japonica[J]. Phytochemistry，2002，59(3)：315.
[5] 韩小龙，陈开勋. 薄层扫描法测定枇杷叶中熊果酸[J].中草药，2005，36(7)：1086.
[6] 杜丰玉，陈 钧，宣 寒.RP-HPLC测定枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的含量[J].中成药 ，2006，28(12)：1790.
[7] 谢天尧，郑一宁.一种简易型毛细管电导检测装置及其作用[J].分析测试学报，2000，19(3)：5.