兜唇石斛多糖提取及脱蛋白工艺研究
2.7 多糖精制精密称取兜唇石斛干燥后粗粉10 g ，加入石油醚(60～90℃)100 ml，回流提取1 h，脱脂。过滤，挥干溶媒，以80%乙醇200 ml回流提取1 h，趁热过滤，挥干溶媒，加入蒸馏水500 ml回流提取2次，每次2 h，趁热过滤，减压浓缩至60 ml，用0.1%活性炭脱色，过滤，加入95%乙醇使溶液含醇80%，静置过夜，分出沉淀物溶于蒸馏水，Sevag法脱蛋白。上清液如上述醇沉，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次。将沉淀如上脱色、醇沉，得到多糖精制品于60℃烘干备用。
2.8 换算因素精确称取60℃干燥至恒重的石斛多糖精制品各10 mg，分别置于100 ml量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。分别精取多糖储备液0.3 ml，按照标准曲线制备的方法操作，测定吸收度。另取葡萄糖标准溶液0.3 ml(含葡萄糖30 μg)，同法操作，求出石斛多糖溶液中的葡萄糖含量，按下式计算换算因素:F=多糖溶液的浓度/多糖溶液中的葡萄糖浓度×稀释倍数。结果见表1。表1 换算因素
2.9 提取工艺
2.9.1 正交实验设计见表2。以提取温度(A)、提取时间(B)、溶剂体积(C)为影响因素，选取3个不同水平，以石斛多糖的含量为考察指标，采用L9(34)正交设计实验进行提取工艺的筛选[7]。表2 多糖提取正交实验
2.9.2 浸提次数实验根据上述实验所得最佳提取条件，取3份样品进行平行实验，分别提取1～3次,研究多糖浸提次数与石斛多糖得率的关系。
2.10 样品测定石斛样品经60℃干燥恒重，粉碎，过60目筛，精密称取0.500 g，置于500 ml的蒸馏烧瓶，加入50 ml石油醚(60～90℃)回流脱脂1h，过滤，挥干溶媒;80%100 ml乙醇提取1 h，残渣用80%热乙醇8 ml洗涤3次;加入200 ml蒸馏水回流提取2 h，趁热过滤，用热水洗涤残渣和烧瓶;冷却后，定容为250 ml。精取上述多糖溶液0.3 ml，按标准曲线项下操作，按下式计算样品中多糖的含量。
多糖含量(%)=Cs×D×F×V/ W 式中：Cs为供试品溶液中葡萄糖浓度(μg/ml)，D为供试品溶液的稀释因素，F为换算因素，V为供试溶液体积(ml)，W为供试品质量(μg)。
2.11 醇沉实验[10]
2.11.1 乙醇浓度取一定量石斛多糖提取液分装于5支离心管中，并分别加入95%的乙醇，使乙醇的终浓度分别为50%，60%，70% ，80% ， 90% ，4℃冰箱中静置过夜，离心，60℃烘至恒重，采用差重法检测乙醇浓度对多糖沉淀效果的影响。
2.11.2 沉淀时间另取5支刻度离心管，分别加入等量的多糖提取液，并用乙醇使其终浓度达到80% 。在醇析12，24，36，48，60 h后，离心，60℃烘至恒重，采用差重法测定沉淀时间对多糖含量的影响。
2.12 Sevag法脱蛋白实验[8]见表3。以石斛粗多糖溶液与氯仿-正丁醇体积比(A)，氯仿与正丁醇配比(B)以及振荡时间(C)等为影响因素进行正交实验，每个处理重复3次，考察Sevag法去蛋白质的效果，分别测定处理前及处理后多糖溶液在280 nm处的吸光值。脱蛋白率(% )=原样品吸光值-脱蛋白后样品吸光值 /原样品中吸光值×100%表3 粗多糖脱蛋白正交实验
2.13 数据处理所有统计分析均采用spss13.0软件和Excel软件处理。
3 分析与讨论
3.1 多糖提取工艺对浸提温度(A)、浸提时间(B)、加水量(C)等3个因素进行正交实验。结果见表4，各因素作用大小关系依次是A>C>B，多糖提取的最佳工艺配比为组合3，即 A1B3C3，提取温度100℃，提取时间2 h，加水量200 ml。从表5可知，浸提温度(A)对兜唇石斛多糖提取含量有极显著的影响意义(P<0.01)，加水量(C)对提取多糖含量有一定影响(0.050.10)。表4 多糖提取正交实验结果表5 多糖提取方差分析
3.2 提取次数 兜唇石斛样品在提取1次后，多糖基本上已被提取完全，最佳提取次数为1次(见表6)。表6 提取次数对多糖提取率的影响
3.3 醇析实验在乙醇终浓度为80%时，多糖含量最高,当浓度更高时析出的多糖会有所下降(图2)。在80%醇析浓度下(图3)，大约在24～36 h之间，多糖含量达到最大值，36 h后多糖含量降低，选择30 h作为沉淀时间。图2 醇沉浓度 图3 醇沉时间
3.4 Sevag法脱蛋白兜唇石斛粗多糖脱蛋白实验结果表明，各因素R值大小分别为振荡时间(C)>样品与氯仿-正丁醇体积比(A)>氯仿与正丁醇体积比(B)，反应时间是影响兜唇石斛多糖脱蛋白的主要因素，兜唇石斛多糖纯化的最佳组合为A2B2C3。即氯仿与正丁醇(V/V)的体积比为4∶1，样品/萃取剂(V/V)的体积比为4∶1，反应时间采用30 min。从表7～8可知，振荡时间(C)对多糖脱蛋白有显著的影响意义(0.010.10)。表7 脱蛋白正交实验结果 表8 脱蛋白正交实验分析
4 结论
兜唇石斛多糖提取最佳工艺，在100℃热水中回流提取2 h，水体积200 ml;醇沉实验的最佳乙醇浓度为80%，沉淀时间30 h;粗多糖脱蛋白的最佳条件，样品/萃取剂(V/V)为4∶1，氯仿/正丁醇(V/V)为4∶1，振荡时间30 min。
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