红车轴草总异黄酮正交提取工艺和大孔树脂吸附分离性能的研究

【摘要】  目的以红车轴草总异黄酮为目的物，筛选最佳提取条件和吸附树脂。方法采用单因素和正交实验法筛选最佳提取工艺，采用静态吸附脱附法筛选最佳树脂。结果红车轴草总异黄酮最佳提取工艺为：提取温度为80℃，提取时间为1 h，料液比为1∶12，碱水pH为11，提取2次，树脂D103是有较好的吸附脱附效果。结论采用此法可较好地提取、富集、纯化红车轴草总黄酮。

【关键词】  红车轴草; 总异黄酮; 正交实验; D103大孔树脂

　红车轴草Trifolium pratense L.为豆科多年生草本植物，现在我国已进行大面积栽培。文献报道其提取物具有抗肿瘤，治疗胃溃疡、胃癌、乳腺癌和骨质疏松症等作用[1]，其主要活性成分为异黄酮类化合物，如大豆素、染料木素和鹰嘴豆芽素等[1，2]，这些异黄酮化合物具有植物雌激素样作用，能够双向调节人体内的激素水平，当人体雌激素水平不足时，它与人体雌激素受体结合，产生弱雌激素作用，以弥补人体自身雌激素的不足;当人体雌激素水平过高时，它与人体雌激素受体结合，从而阻止人体自身所分泌的雌激素与受体结合，达到降低人体雌激素水平的目的，因而对妇女有关体内激素方面的疾病具有预防、保健和医疗作用[3]，其提取物广泛用作保健食品或功能食品的原料，因而备受人们关注。目前有关红车轴草的提取工艺主要以乙醇为提取溶剂，由于乙醇系有机溶剂，消耗大、成本高、且生产过程存在易燃等安全隐患，为此我们根据红车轴草异黄酮有一定的水溶性，改用水做提取溶剂，以总异黄酮为目标，对其总异黄酮进行了正交提取工艺研究，并对最佳提取工艺得到的提取液进行了大孔吸附树脂吸附分离性能研究，以期为红车轴草总异黄酮的开发利用提供依据。

　　1 材料与仪器

　　1.1 材料 红车轴草(采自乐山师范学院)的植物地上部分，除去杂草，60℃鼓风干燥7 h，粉碎。

　　1.2 试剂鹰嘴豆芽素对照品(含量≥98%)：购自Sigma公司;大孔树脂D101，D102，D103，D104，购自天津市大钧科技开发有限公司。试剂为分析纯。

　　1.3 仪器 电热恒温水浴锅(H·H·S21-6C，上海医疗器械五厂);电子分析天平(FC204，上海精科实业有限公司);UV -762紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);旋转蒸发器(上海亚蓉生化仪器厂);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，索式提取器，电热鼓风干燥箱;植物粉碎机(FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司)。

　　2 方法

　　2.1 总异黄酮的含量测定

　　2.1.1 测定波长的选择将鹰嘴豆素对照品、红车轴草异黄酮提取液配成适当浓度，在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，二者吸收曲线类似，均在258 nm处有最大吸收，故选择285 nm为测定波长。

　　2.1.2 对照品溶液的配置和标准曲线的制备精密称取干燥至恒重的鹰嘴豆芽素对照品4.0 mg，置于50 ml容量瓶中，加入95%的乙醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即可。精密吸取0.0 ，0.3，0.6，0.9，1.2，1.8，2.4 ml标准液，分别置于10 ml容量瓶中，各自加入95%的乙醇1 ml，加蒸馏水定容，摇匀，在波长258.5 nm处测定吸收值。得回归方程为：C=0.009 68A+0.000 06， r=0.999 1, 结果表明，鹰嘴豆芽素对照品在2.4～19.2 μg/ml范围内，浓度与吸光度线性关系良好。

　　2.1.3 样品的含量测定按照标准曲线的方法，以鹰嘴豆芽素为对照品测定样品的含量。

　　2.2 红车轴草提取工艺效果的因素实验

　　2.2.1 单因素实验准确称取0.30 g红车轴草粉末置于微型回流装置中，在不同条件下提取以确定提取因素变化范围以及各因素的较佳值。通过测定提取液中总异黄酮含量，计算总异黄酮的提取率，以判断最佳条件。

　　2.2.2 正交工艺实验以水的pH、浸提温度、料液比和浸提时间4种因素作为参考对象，采用正交L9(34)，以获取最佳工艺参数。

　　2.3 大孔树脂静态吸附实验

　　2.3.1 饱和吸附量的测定准确称取经预处理的用滤纸吸干表面水分的树脂0.50 g于50 ml三角瓶中，精密加入1.06 mg/ml的红车轴草总异黄酮溶液10.0 ml，在25℃，180 r/min的条件下振荡吸附24 h。测定吸附后溶液中总异黄酮的量，并按下式计算树脂的饱和吸附量。饱和吸附量=(加入的总异黄酮-未吸附的总异黄酮)/ 树脂的量

　　2.3.2 树脂脱附率的测定将上述经过24 h静态吸附总异黄酮的树脂分离出来，吸干表面水分，然后加入70%的乙醇5.0 ml，在25℃，180 r/min的条件下振荡脱附2 h。测定脱附液中总异黄酮的量，按下式计算脱附率。脱附率(%)=洗脱出的总异黄酮/(加入的总异黄酮-未吸附的总异黄酮)×100%