左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素表达与HPA轴活性作用的实验研究
作者：姚建平， 金国琴，戴薇薇， 姚龄爱，康湘萍
【摘要】 目的观察老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）表达和血清皮质酮（CORT）含量变化和左归丸、右归丸对其的影响，探索老年肾虚大鼠CRH多肽表达与下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴活性的相关性及左归丸和右归丸的作用。方法以自然衰老SD雄性大鼠（24月龄）为肾虚衰老模型，大鼠随机分为老年对照组、左归丸组和右归丸组，每组35只，另设青年对照组（5月龄）35只，共4组。老年对照组大鼠常规喂养至24月龄。左、右归丸组大鼠自20月龄始，均按相当于左、右归丸生药7.5g·kg-1（成人临床用量的15倍）自由饮用稀释药液，每周停药2 d，连续4个月；采用Western Blot检测大鼠杏仁核CRH多肽表达, 放免检测血清CORT含量。结果与青年对照组比较，老年对照组大鼠杏仁核CRH多肽表达及血清CORT含量显著增高（P<0.05），与老年对照组相比，左归丸组及右归丸组大鼠杏仁核CRH多肽表达及血清CORT含量显著下降（P<0.05）。结论 左归丸、右归丸通过调节杏仁核CRH多肽表达进而调节衰老大鼠HPA轴功能。
【关键词】 促肾上腺皮质激素释放激素； 肾虚； 左归丸； 右归丸
下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴是重要的神经内分泌调节系统之一，与衰老密切相关。下丘脑分泌的促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）对HPA轴发挥主要调节作用。近年研究表明，杏仁核也存在高表达的CRH，杏仁核可以通过CRH能神经元直接作用于下丘脑，促进HPA轴活性［1］，提示杏仁核参与HPA轴调节，协同维持HPA轴的神经内分泌稳态调控水平。本实验以自然衰老大鼠为肾虚衰老模型，探索杏仁核CRH表达与HPA轴功能调节的相关性及左归丸、右归丸的作用。
1 材料与仪器
1.1 动物雄性Sprauge-Dawley（SD） 大鼠，清洁级，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：2003-0002。
1.2 试剂兔抗鼠CRH多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）；大鼠皮质酮放免检测试剂盒（Diagnostic Systems Laboratories,Inc）；中药（饮片）。
1.3 仪器垂直电泳及电转移装置（Bio-Rad Company）；γ-射线计数仪（Beckman Company）。
2 方法
2.1 动物分组、造模与给药 105只SD雄性大鼠，随机分为3组：老年对照组、左归丸组、右归丸组，每组35只。另设青年对照组35只，共4组。温度18～22℃，光暗周期12 h∶12 h，群养，5只/笼，常规喂养饲料，自由饮水。以自然衰老SD雄性大鼠（24月龄）为模型，老年对照组大鼠常规喂养至24月龄。左、右归丸组大鼠从20月龄始，均按左、右归丸生药7.5 g·kg-1（相当成人临床用量的15倍）自由饮用稀释药液，每周停药两天，连续4个月。
2.2 药材及制剂左、右归丸组方及用量均参照《方剂学》第1版教材，原方用量（单位：g）左归丸：熟地24，山药12，枸杞子12，山茱萸12，川牛膝9，菟丝子12，鹿角胶12，龟甲12， 右归丸：熟地24，山药12 ，山茱萸9，枸杞子 9，菟丝子12 ，鹿角胶 12，炒杜仲12，当 归9，肉 桂6，炮附子6。中药（饮片）一次性购于上海华宇药业有限公司，两方均按原方用量比例水煎，浓缩成膏，-30℃保存。
2.3 取材
大鼠腹腔麻醉（25%乌拉坦，0.75 mg/kg），用消毒手术器械取大鼠杏仁核，置于高压蒸气灭菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
2.4 Western Blot法检测大鼠杏仁核CRH多肽表达
蛋白样品制备：称取样品100 mg放入消毒处理试管→加入RIPA 900 μl，冰浴匀浆→匀浆后立即加入100 μl PMSF(100 μg/ml)液→转移到1.5 ml离心管中并加40 μl（10μg/μl） Complete液→4℃，10 000 r﹒min-1，离心10 min→取上清液，-70℃冻存→24 h后，4℃，10 000 r/min，离心10 min→取上清，分装，-70℃保存待测； 蛋白样品浓度检测：参考马斯亮蓝试剂盒（南京建成）说明，595 nm波长测各样品吸光值，参照公式“蛋白浓度=测定管吸光值/标准管吸光值×标准管浓度”检测各样品蛋白浓度；蛋白样品电泳分离：取含蛋白40 μg的样品（样品加1/5总体积的LB，最后用RIPA补齐至总体积至25 μl，混匀后95℃煮5 min）上样，在聚丙烯酰胺凝胶上（12%的分离胶，约3/5总体积，4%的堆积胶，约2/5总体积）电泳分离蛋白样品（100 V，4℃，2 h）；蛋白样品电转移及预染：按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-三层滤纸-海绵-红色板）。并完全排除气泡，4℃，100 V转膜2 h；将硝酸纤维素膜放入丽春红染液中染色约2～5 min，去离子水漂洗至现出条带，用铅笔标出蛋白Marker位置，再用去离子水振荡以去除染色；抗原抗体反应及显色：将膜转移至一培养皿中，37℃，用5%脱脂奶粉封闭1 h（或4℃过夜）→将膜转移至塑料夹膜中，并加入1︰200稀释的兔抗大鼠CRH一抗→37℃摇床孵育约2 h→0.1 moL/L的PBST洗涤4次，每次5 min→将膜转移至塑料夹膜中，并加入1︰400稀释的山羊抗兔辣根过氧化酶标记的二抗，37℃摇床孵育约30 min→0.1 mol/L的PBST洗涤4次，每次5 min→将膜转移至塑料夹膜中，并加入DAB显色剂（显色时间视染色程度定）→去离子水洗膜；扫描及分析。