六味地黄颗粒对哮喘大鼠炎症介质白三烯β4、白三烯C4及5脂氧合酶影响的研究
2.2 标本采集及指标检测
2.2.1 标本的采集及肺组织病理学观察从实验大鼠中每组随机抽取10只，最后一次激发后12 h，20%乌拉坦5 ml/kg麻醉下处死。放血后打开胸腔取右肺部分组织，10%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色，观察气道及肺组织病理学改变。
观察方法：观察切片至少5个具有代表性的高倍视野，以每个视野中气道上皮细胞脱落及肺组织炎症细胞所占的比例，可得出气道上皮细胞和肺组织的炎症程度，观察结果：以“±”表示和文字描述。每个视野中气道脱落的上皮细胞及肺组织炎症细胞所占比例小于15%为正常范围，用“-”表示;16%～30%为轻度，用“+”表示;31%～60%为中度，用“++”表示，大于60%为重度，用“+++”表示。
2.2.2 白三烯β4、白三烯C4的测定取肺组织100 mg，加入磷酸盐缓冲液1.5 ml，内切式组织匀浆机匀浆，1 500 r/min离心10 min，上清液采用双抗夹心酶联免疫吸附实验(sandwich ELISA)检测肺组织匀浆液中TLB4、TLC4的含量，实验过程参照试剂说明书进行， 自动酶标仪测定每孔的光密度(OD)，并根据标准曲线求得所测样品浓度。
2.2.3 5-脂氧合酶的免疫组化检测取大鼠左肺一叶，10%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，固定36 h，使用免疫组化染色试剂盒进行免疫组化及染色，严格按照说明书进行操作，每一批免疫组化均设有用磷酸盐缓冲液代替一抗的阴性对照。采用盲法进行免疫组化评估，观察切片至少5个具有代表性高倍视野，不少于1 000个细胞，对免疫组化结果进行评估。结果的判定采用记分法，根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅记分。阳性细胞比例30%以下为1分，30%～60%为2分，60%以上为3分;细胞无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，黄褐色为3分。根据二者乘积判断阳性等级：0分为阴性“-”，1～3分为弱阳性“+”，4～6分为阳性“++”，大于6分为强阳性“+++”。
2.3 统计学分析在计算机上建立数据库，通过SPSS17.0软件进行统计学处理，各组间比较用秩和检验及方差分析F检验。以P<0.05判定结果有无显著性差异。
3 结果
3.1 各组大鼠造模过程中表现及行为学评价观察发现哮喘模型组(F组)大鼠进行激发前(第14天)出现明显的过敏反应(明显的头部瘙痒、烦躁)，激发一周后(第21天)逐渐出现喷嚏、前肢缩抬、呼吸加快或安静少动，激发到两周后(第28天)大鼠出现节律性收腹样喘促，甚至喘促至死。六味地黄颗粒组(A组)及其他各组与哮喘模型组比较，过敏反应轻微，稍有呼吸改变，未见明显喘促。但是六味地黄颗粒辅助地塞米松组(B组)及地塞米松组(C组)与其他各组相比，体质量明显减轻。空白对照组(H组)大鼠正常成长，未见异常表现。参考文献方法[3]，建立评分标准并对各组实验大鼠在造模过程中的行为学表现进行评分。见表1。表1 各组大鼠造模过程中的行为学评分结果
3.2 肺组织病理学改变 哮喘模型组大鼠的肺组织HE染色可见支气管上皮细胞肿胀、脱落，支气管平滑肌收缩，管腔狭窄，支气管壁及管腔内有大量炎症细胞浸润。六味地黄颗粒治疗组病理学改变轻微，生理盐水组大鼠支气管上皮细胞有不同程度的脱落，肺组织炎症细胞明显。空白对照组大鼠的支气管肺组织未见明显改变。见图1。 图1 各组实验动物肺组织病理学变化
3.3 各组大鼠气道上皮细胞脱落及炎症细胞浸润程度 结果见表2。高倍镜下观察气道上皮细胞脱落情况可见：各处理组间气道上皮细胞脱落程度有差异(H=35.217,P=0.000);哮喘模型组(F组)的HE染色切片中气道上皮细胞脱落程度较重，与空白对照组(H组)比较，具有显著差异(P<0.01);六味地黄颗粒组(A组)、六味地黄颗粒辅助地塞米松组(B组)、地塞米松组(C组)、六味地黄颗粒辅助布地奈德组(D组)、布地奈德组(E组)脱落程度较哮喘模型组明显减低，差异也具有显著性(P<0.05)。