委陵菜抗糖尿病有效成分分离工艺的研究

　　2.3  AB-8树脂柱洗脱条件考察［4］

　　2.3.1  泄漏曲线及洗脱曲线取已经处理好的AB-8树脂50 g湿法装柱，以30%乙醇溶解适量提取物，离心，上样，流速2 BV/h，按倍量收集过柱液，测定委陵菜黄酮及提取物的浓度。结果见图1～2。
   
　　根据委陵菜黄酮和提取物的泄漏曲线，选择上样量为10倍量柱体积。将泄漏曲线步骤中吸附饱和的树脂分别以5倍量40%，50%，60%乙醇洗脱，测定洗脱液中黄酮单体的浓度。结果见图3。

　　2.3.2  吸附流速考察在“2.3.1”项下柱层析条件下，选择上样流速为1，2，3，4，5 BV/h进行实验，考察吸附量。由图4可见，随着吸附流速的提高，委陵菜黄酮的吸附量呈逐渐下降，而提取物的吸附量则在4 BV/h时达到最高。在委陵菜黄酮吸附量较高条件下，提取物吸附量较少，有利于委陵菜黄酮的纯化，故选择2 BV/h作为吸附流速。
　
　　2.3.3  洗脱流速考察在“2.3.1”项下柱层析条件下，选择洗脱流速为1，2，3，4 BV/h进行实验，从图5可知，4种流速的洗脱均需要约5倍量柱体积才能洗脱完全。考虑到较高流速需要加压，因此选择与吸附流速同样的速度洗脱为宜。

　　2.4  第2次分离实验以AB-8树脂柱分离药材提取物，洗脱组分中委陵菜黄酮的含量由0.3%提高了10～12倍（近4%），但仍需要进一步分离。

　　2.4.1  AB-8树脂柱第2，3次分离考察取第1次AB-8树脂柱分离得到的委陵菜黄酮粗组分，按照上述条件依次进行2，3次分离，计算60%乙醇洗脱流分中委陵菜黄酮含量。结果见表3。表3  AB-8树脂第2，3次纯化分离（略）

　　由表3可知，AB-8树脂柱第2次分离，委陵菜黄酮的含量提高了约2倍，而继续第3次分离时没有纯化效果，有必要选择其他的色谱填料进行纯化。

　　2.4.2  聚酰胺纯化取第1次AB-8树脂柱分离得到的委陵菜黄酮粗组分，以聚酰胺色谱柱分离，按照“2.3”的柱色谱条件依次以30%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇洗脱，每个梯度5BV，测定各洗脱流分中委陵菜黄酮的含量。结果见图6。

　　由图6可知，聚酰胺色谱柱分离委陵菜黄酮粗组分，委陵菜黄酮含量明显大于AB-8树脂柱的两次分离流分，而30%～60%乙醇洗脱流分中黄酮的含量达到18.3%，提高了4.5倍以上，因此选择聚酰胺作为第2次分离的柱填料。

　　3  小结
    
　　根据上述考察结果，确定委陵菜黄酮分离工艺为：将委陵菜60%乙醇提取物，按照重量比10倍量30%乙醇溶解，离心，取上清液，以AB-8大孔吸附树脂柱分离，10 BV上样，吸附和洗脱流速为2 BV/h，依次以3 BV30%乙醇、5 BV60%乙醇、4 BV95%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到的混悬液以等体积30%乙醇溶解，离心，上清液以聚酰胺柱分离，10 BV上样，依次以3 BV30%乙醇、5 BV60%乙醇、4 BV95%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱流分，减压浓缩得到委陵菜黄酮粗品（3批次含量18%～19%）。

【参考文献】
  　　［1］赵 川, 乔 卫, 张彦文,等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究［J］.中国中药杂志,2008，33(6)：680.

　　［2］刘 臣，张君寿. 大孔吸附树脂分离纯化刺五加苷D的研究［J］.中成药，2004，26（9）：701.

　　［3］杨荣平，王宾豪，方艾权，等. 大孔树脂分离葛根总黄酮工艺优化［J］.中成药，2004，26（10）：784.

　　［4］安彩贤，李冶姗. 大孔吸附树脂分离纯化葛根与山楂叶中总黄酮的研究［J］.中成药，2004，26（9）：698.