通络救脑口服液对AD大鼠学习记忆能力及nNOS、SS表达的影响

                     作者：董海影，张春庆，宫国良，张晓杰

【摘要】  目的观察通络救脑口服液对β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)诱导的AD大鼠学习记忆障碍的改善作用及对神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、生长抑素(Somatostatin, SS)蛋白表达的影响。方法采用大鼠海马立体定向注射凝聚态Aβ1-40诱导老年性痴呆(Alzheimer’s disease, AD)动物模型。采用Morris水迷宫测试大鼠寻找平台所需时间和通过原平台次数评价大鼠学习记忆能力及通络救脑口服液干预作用。采用免疫组织化学染色法和计算机图像分析技术测定海马区nNOS、SS蛋白阳性目标积分光密度。结果与假手术组比较，模型组平均逃避潜伏期显著延长，跨越原平台位置次数明显减少(均为P<0.01);与模型组比较，通络救脑口服液组(12，24，48 mg·kg-1·d-1)平均逃避潜伏期显著缩短，跨越原平台位置次数明显增加(P<0.01)。免疫组化实验结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠海马区nNOS、SS蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较，通络救脑口服液各剂量组nNOS、SS蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论通络救脑口服液通过上调nNOS、SS蛋白表达水平，从而发挥其抗老年性痴呆的作用。

【关键词】  阿尔茨海默氏病;通络救脑口服液;神经元型一氧化氮合酶;生长抑素

　阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease, AD)发现至今已百年，但由于其病因不完全明确，迄今尚无有效的防治药物。就目前的进展来看，有关防治的药物研究主要还是延缓患者的死亡、部分阻止或延缓疾病的发作和改善患者的生活质量，并提倡多因素、个性化治疗[1，2]。传统中药不但成本低廉，且可作用于多靶点，毒副作用小，具有其独特的优势。因此，结合AD的病因研究，在传统中药中寻找防治的有效药物成分是十分有意义的尝试。本研究采用海马立体定向注射Aβ1-40方法建立大鼠AD模型，并用通络救脑口服液(TLJN Oral Solution)灌胃进行药物干预，观察TLJN对AD大鼠学习记忆能力及nNOS、SS蛋白表达的影响，以探讨TLJN对AD可能的防治作用。

　　1材料与仪器

　　1.1 药物与试剂通络救脑口服液，由北京中医药大学中药学院制备。盐酸多奈哌齐片由法国PFIZER PGM公司制造，产品批号5136903。Aβ1-40为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Aβ1-40使用前用无菌生理盐水稀释成10μg·μl-1，37℃孵育1周，使其变为聚集状态的Aβ。Rabbit Anti-SS、Rabbit Anti-nNOS及SABC即用型试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

　　1.2 动物与分组140只SD雄性大鼠，鼠龄8～12周，体质量(280±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK(京)2002-0003。经适应性饲养1周，随机分为7组：空白对照组、假手术组、模型组、盐酸多奈哌齐组和TLJN 的3个剂量组(12，24，48 mg·kg-1·d-1)，每组20只。

　　1.3 仪器MORRIS水迷宫系统(中国医学科学院药物研究所)，江湾Ⅰ型C立体定向器(第二军医大学)。

　　2方法

　　2.1 动物模型的制作实验大鼠1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，立体定向仪固定头部，备皮消毒，沿颅顶中线作2 cm切口，分离骨膜暴露头骨，于前囟向后3.0 mm，中线左右各旁开2.2 mm，用牙科钻打开颅骨，垂直进微量进样器针2.8 mm，将1 μl溶液缓慢注入，注射时间为5 mm，留针5 min，模型组、盐酸多奈哌齐组、通路救脑口服液各剂量组左右侧海马各注射1 μl Aβ1-40(10 μg)溶液，假手术组注射1 μl生理盐水。

　　2.2 给药方法 造模后3 d开始给药，盐酸多奈哌齐组按0.33 mg·kg-1·d-1，各通络救脑口服液组按12，24，48mg·kg-1·d-1给药，1次/d灌胃，其余3组给等体积生理盐水，共4周。

　　2.3 学习记忆能力的测定给药后进行Morris水迷宫行为测试。水迷宫为一不锈钢圆形水池(内壁贴上了黑色胶膜)，直径150 cm，高60 cm，内置有机玻璃平台(外贴黑色胶膜)，平台高40 cm，底面为6 cm×10 cm。在水池壁东、西、南、北部位分别标明入水点。将平台放在西南象限正中距池壁22 cm处，水温(22±1)℃。训练期间环境安静，迷宫外参照物不变。　Morris水迷宫实验前5天为定位航行试验(place navigation test)，每天从东入水点头朝池壁将大鼠放入水池，使其自由游泳，自动摄像系统记录大鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)，设定60 s为最长逃避潜伏期，60 s后自动停止记录。实验第6天为空间探索试验(spatial probe test)。定位航行试验结束后撤除平台，将动物每天分别从东入水点面向池壁将大鼠放入水池，测试1 min内跨原平台位置的次数(the times of traversing flat roof)。

　　2.4 nNOS、SS蛋白表达的检测 行为学试验后，大鼠断头取脑，分离出的海马用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，冠状切片，切片厚3 μm。切片常规脱蜡至水，3%H2O2，室温孵育10 min。微波热修复抗原。用正常山羊血清工作液室温封闭10 min。1∶200比例稀释的Rabbit Anti—NOS(SS蛋白的检测使用稀释的Rabbit Anti—SS)4℃冰箱过夜。滴加生物素化二抗工作液37℃，20 min。滴加试剂SABC 37℃，20 min。以上各步骤均用PBS漂洗3次，DBA显色后苏木精淡染胞核，脱水、透明、封片，光镜下观察。图像分析：采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，对每个统计场nNOS，SS蛋白阳性细胞的积分光密度进行测量。每组6例大鼠，每张切片观察5个视野。

　　2.5统计学方法所有数据运用SPSS13.0软件包进行处理。定位航行试验各组间逃避潜伏期差异采用重复测量多因素方差分析。nNOS1和SS阳性目标积分光密度之间的差异采用单因素方差分析，进一步post-hoc分析方差齐采用SNK检验。

　　3结果

　　3.1 对大鼠定位航行试验逃避潜伏期的影响5 d逃避潜伏期变化见图1。图1空间探索试验各组大鼠逃避潜伏期变化不同时间大鼠逃避潜伏期有显著差异(F=181.771, P<0.01)，空白组、模型组、假手术组、盐酸多奈哌齐组、通络救脑口服液3个剂量组均如此，F值分别为36.441，24.725，8.159，32.870，38.231，32.700和26.358，均为P<0.01。从图1可以看到，5 d的定位航行试验中，各组大鼠的平均逃避潜伏期总体呈下降趋势。表明大鼠通过多次训练，已经学会寻找平台而学习记忆能力增加，但各组大鼠的学习记忆能力不同。从各时间点看，第1天各组大鼠逃避潜伏期无显著差异(F=0.183，P=0.856)，第2天、第3天、第4天和第5天，模型组大鼠平均逃避潜伏期较正常组明显延长(P<0.01);通络救脑口服液和盐酸多奈哌齐组大鼠平均逃避潜伏期较模型组明显缩短(P<0.05)，而盐酸多奈哌齐组和通络救脑口服液3个剂量组之间无显著性差异(P>0.05)。各时间点和不同组别之间存在交互效(F=2.4121，P<0.01)。表明模型组大鼠学习获取能力较差，而通络救脑口服液能改善模型大鼠的学习巩固和再现能力。

　　3.2 对大鼠空间探索试验跨越原平台位置的次数的影响第6天各组大鼠跨越原平台位置的次数比较见图2。与正常组比较(5.65±1.50)，模型组大鼠跨越原平台位置次数(1.89±1.23)明显减少(P<0.01);通络救脑口服液通络救脑3个剂量组(3.17±1.09，3.50±1.25，4.78±1.31)和盐酸多奈哌齐组(3.68±0.89)大鼠跨越原平台位置次数较模型组明显增加(P<0.01);与盐酸多奈哌齐组比较，通络救脑口服液高剂量组跨越原平台位置次数增加(P<0.01)。与模型组比较，*P<0.01;与盐酸多乃哌齐比较，#P<0.01图2各组大鼠跨越原平台次数比较图