液体中药制剂中苯甲酸和山梨酸含量的高效毛细管电泳法测定
作者：李玉琴 ，贾宝秀，崔英杰，郭丰广，齐永秀，樊淑文
【摘要】 目的利用高效毛细管电泳技术分离测定液体中药制剂中苯甲酸和山梨酸的含量。方法采用未涂层熔融石英毛细管柱(50.2 cm×75 μm,有效长度40 cm)，以50 mmol/L硼砂(pH=9.5)为运行缓冲液，分离电压20 kV，柱温25℃，检测波长228 nm进行测定。结果苯甲酸和山梨酸的线性范围分别是2.5～200.0 μg/ml(R2=0.999 7)，2.5 ～200.0 μg/ml(R2=0.999 4)，检测限分别为1.50 ng/ml，1.54 ng/ml，检测灵敏度高，精密度良好;将此方法应用于实际样品测定，苯甲酸和山梨酸的回收率分别为98.61 %～103.3 %，98.12 %~102.5 %。结论该法简单快速、准确可靠、灵敏度高，为药物中微量的苯甲酸和山梨酸检测提供简便易行精确的方法。
【关键词】 高效毛细管电泳;山梨酸;苯甲酸;液体中药制剂
随着人们药品安全意识的增强，药品中添加剂的限量问题日益受到人们的关注，药品的特殊性使其质量检测变得更为重要。液体制剂特别是以水为溶剂的液体制剂，易被微生物污染而发生霉变，尤其是含有糖、蛋白质等营养物质的液体制剂，更容易引起微生物的滋长和繁殖，从而引起理化性质的变化，严重影响制剂质量，有时会产生细菌毒素危害人体[1]。苯甲酸和山梨酸作为防腐剂是药物制剂中常用的添加剂，用于防止药物制剂由于细菌、酶、霉等微生物的污染而产生变质。毛细管电泳(CE)是依据荷电离子在毛细管中以电场力为推动力，按其淌度差别而进行分离的技术，具有应用范围广、高效、 快速、 仪器操作简单、 样品和试剂耗用量少、 抗污染能力强[2]、 可供选择的分离模式多、 适应性广等特点。毛细管电泳在药物分析、中药成分分析、 手性对映体分析、 医学临床检验、 法医及单细胞分析等方面已得到广泛应用;被分析的物质有离子、 小分子药物、 基因工程产品、 蛋白、 DNA基因诊断、 手性对映体等[3～5]。本文利用高效毛细管电泳法测定液体中药制剂中常用防腐剂山梨酸和苯甲酸的含量，旨在为药物中微量成分(辅料)的检测提供简便易行精确的方法。
1仪器与试剂
1.1仪器BenckmanP/ACETMMDQ型毛细管电泳仪(Benckman Coulter公司，美国)，32KaratTM Software ver 5.0工作站采集和处理数据，二极管阵列检测器，弹性石英毛细管(Benckman Coulter公司)，50.2 cm×75 μm i.d，有效长度40 cm，PHS-29A型酸度计(上海精密科学仪器有限公司)，METTLER TOLED O AX205型分析天平。
1.2试剂和材料苯甲酸和山梨酸对照品购于中国药物生物制品检定所，直接使用没有进一步纯化，其它化学试剂均为分析纯。川贝清肺糖浆(北京龙泰基药业有限责任公司，批准文号：国药准字Z11021256，产品批号：0807001)，蛇胆川贝液(广西灵峰药业有限公司，批准文号：国药准字Z45022081，产品批号：3108029)购于泰安当地药店。不同浓度的缓冲溶液由0.2 mol/L硼砂溶液稀释而成，其pH值用2 mol/L NaOH和2 mol/L HCl调节。实验中所用水均为纯化水。所有溶液在使用前均用0.45 μm的滤膜过滤。
2方法
2.1溶液配制
2.1.1标准溶液的制备分别精密称定一定量的苯甲酸和山梨酸对照品，用20 %的甲醇配置成1 000 g/ml的混合储备液。实验时，工作溶液由储备液用20 %的甲醇稀释到所需浓度。
2.1.2样品溶液的制备精密称取5.006 g蛇胆川贝液，置于250 ml的分液漏斗中，加30 ml蒸馏水，混匀后加入1.5 ml 的6.0 mol/L HCl，用30 ml×2无水乙醚提取，合并提取液于容量瓶，用乙醚定容至50.0 ml，在40℃水浴中挥干乙醚，用20%甲醇定容至2.0 ml，用0.45 μm的微孔滤膜过滤后备用。川贝清肺糖浆处理方法同上。
2.2实验方法CE条件：缓冲溶液，pH 9.5的50 mmol/L硼砂溶液;分离电压20 kV;柱温25℃;阳极压力进样(0.5 psi×5 sec)，阴极紫外检测，检测波长228 nm。新毛细管前使用(内壁未经处理)，分别用0.1 mol/L NaOH(10 min)、蒸馏水(10 min)、缓冲溶液(10 min)依次冲洗毛细管。为了使毛细管内表面保持一致，两次运行之间，依次用蒸馏水(2 min)、0.1 mol/L NaOH(2 min)、蒸馏水(2 min)、缓冲溶液(2 min)冲洗毛细管，以提高迁移时间、峰面积和峰高的重复性。通过加入纯对照品和比对吸收光谱鉴定苯甲酸、山梨酸的峰。
3结果
3.1缓冲溶液pH的影响在毛细管区带电泳中，缓冲溶液的pH对于可离解的化合物的分离效果影响很大，因为它能决定每个分析物所帯电荷的种类和大小。在7.5～10.0范围内调节50 mmol/L硼砂缓冲溶液，在20 kV分离电压下考察pH对山梨酸和苯甲酸峰高和分离度的影响(图1)。由图1可知，峰高开始随着缓冲液pH的增大而增大，当pH到9.5时， 山梨酸和苯甲酸的峰高达到最大;且随着pH值的升高，分离度也在于9.0时达到极值。综合峰高和分离度，选择9.5为缓冲液的最佳pH值。