蛇菰内生菌的抑菌作用及活性有效成分分析

                  作者：张亚雄，涂璇，胡滨，邓义熹，喻晨

【摘要】  目的研究蛇菰内生菌的活性有效成分抑菌作用。方法通过对分离纯化的49株筒鞘蛇菰内生真菌进行纯化液体发酵，发酵液经乙酸乙酯和正丁醇萃取，并对乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分别采用牛津杯法研究蛇菰内生菌发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌的抑菌作用。结果有18株蛇菰内生菌发酵液对细菌有抑菌作用。抑菌活性物在乙酸乙酯相中。通过薄层色谱和化学反应得出乙酸乙酯相中物质有黄酮类和甾体类。结论分离得到的18株蛇菰内生菌发酵液乙酸乙酯萃取相的黄酮类和甾体类有抑菌作用。

【关键词】  筒鞘蛇菰;内生菌;抑菌作用

　筒鞘蛇菰Balanophora involucrata Hook. f. 又名鹿仙草,为蛇菰科蛇菰属草本寄生植物，是我国传统道地中药材，具有凉血止血、清热解毒的功能，主治肺热咳嗽、吐血、肠风下血、风热癍疹、腰痛、疔疮肿毒等，民间也用于治疗肝炎、肿瘤等疾病，为传统民族用药, 我国有丰富的资源。分离的蛇菰内生菌并对其代谢产物进行研究，以期从微生物角度寻找其活性化合物，为研制新药开辟新的思路。本课题以分布于神农架地区的思茅蛇菰为研究对象进行其内生真菌的活性成分分离纯化筛选，并对蛇菰内生菌的代谢产物进行抑菌研究，以期寻找有效活性化合物。

　　1材料

　　1.1供试植物及菌株筒鞘蛇菰Balanophora involucrata Hook. f.，采自湖北省神农架。

　　1.2抑菌指示菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。

　　2方法

       从蛇菰中分离出49株内生真菌经纯化扩大后，经发酵培养，得到发酵液。取发酵浓缩液对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌进行抑菌测试。筛选出最佳抑制细菌的内生真菌，对相应菌株扩大摇瓶培养，用醋酸乙酯和正丁醇对此菌株发酵液进行萃取，分别用醋酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏对以上4种细菌进行抑菌测试，筛选出有效抑菌活性物质存在于何相中，并对有效抑菌活性物质作简要分析。

　　2.1发酵培养基PDA培养基：土豆200 g，蔗糖20 g，水1 000 ml，pH自然。

　　2.2发酵浓缩液的制备将菌种接于摇瓶后于28℃，100~110 r/min的摇床中培养5~9 d，待发酵液清澈并有大量菌落生长后取出。加入1~2 ml甲醇，用电动搅拌器在适当转速下对发酵液进行搅拌破碎。用32层纱布过滤，于 45℃下浓缩至50 ml左右。然后在5 000 r/min离心机中离心20 min，取上清液，冰箱保存备用。

　　2.3发酵浓缩液的抑菌实验采用牛津杯法。用混菌法或涂布法在每平皿加0.1 ml菌悬液，室温，吸附1 h，然后在上面均匀放置4个直径为6 mm的无菌不锈钢牛津杯。其内加离心发酵浓缩液200 μl;于37℃恒温培养12 h后，观察并记录抑菌圈的有无及其直径大小(每平皿4个牛津杯对称2种浓缩液，求直径的平均值)。筛选出最佳抑菌内生菌株。

　　2.4发酵液经乙酸乙酯、正丁醇后的抑菌实验对最佳抑菌内生菌株扩大培养，其发酵液用乙酸乙酯、正丁醇萃取浓缩后，将乙酸乙酯相、正丁醇相、水相浸膏于真空干燥葙干燥，然后配成浓度为10-2，10-3，10-4 g/ml和10-5g/ml样液。依据牛津杯法进行抑菌试验，两个抑菌圈直径的平均值即为最小抑菌浓度(MIC)。

　　2.5抑菌活性化合物薄层色谱分离将溶于三氯甲烷中的样品在硅胶薄板上点板后于层析缸内垂直展开，展开剂为氯仿和甲醇的配比液。然后用5%的磷钼酸溶液进行显色。

　　2.6化学鉴定反应

　　2.6.1盐酸-镁粉反应[1]鉴定黄酮类。将样品溶于1.0 ml甲醇或乙醇中，加入少量镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，1~2 min内(必要时微热)即可显色。多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及其醇类化合物显橙红至紫红色。

　　2.6.2salkowski 反应[2]鉴定甾体皂苷类。 将样品溶于三氯甲烷中，加入适量浓硫酸，分层后，上层三氯甲烷显血红色或青色。下层浓硫酸显绿色荧光。