熟地黄粗多糖提取与初步纯化工艺研究

　　2.6单因素实验优选脱蛋白工艺

　　2.6.1方法[6]称取熟地黄饮片50.0 g，按优选的水提醇沉工艺，药液定容至相当于原药材0.5 g/ml。分别吸取4份，均为10 ml，至已经干燥的小烧杯中，加1 mol/L的NaOH调pH至8～9。水浴加热至85℃，加入无水氯化钙使浓度(W/V)分别达到3%，5%，7%，10%。搅拌溶解，取出，放至室温，离心15 min，3 000 r·min-1，弃沉淀，定容。

　　2.6.2多糖保存率和蛋白脱除率测定用“2.1”项方法测得多糖含量，计算多糖保存率。按“2.3”项测定蛋白含量，计算多糖保存率和蛋白脱除率。计算公式如下。多糖保存率(%)= 脱蛋白前多糖含量-脱蛋白后多糖含量脱蛋白前多糖含量×100%　　蛋白脱除率(%)= 脱蛋白前含量-脱蛋白后含量脱蛋白前含量×100%

　　2.7熟地黄粗多糖提取、纯化工艺验证性实验取3批熟地黄药材，按以上优选的工艺进行提取、纯化，药液干燥至恒重，测定收膏率和多糖含量。

　　2.8实验结果

　　2.8.1熟地黄多糖水提工艺结果结果见表2～3。表2水提工艺实验结果表3熟地多糖提取工艺综合评分方差分析结果由直观分析可知，影响水提因素顺序为：C>A>B，即提取次数>加水量>提取时间。但各因素并没有显著性差异，考虑多糖一般提取时间较长，根据正交结果表2，B选择B1，C、A根据生产实际考虑，可选择C3A3，综合选择最优方案为 A3B1C3。即加8倍量水，提取2次，每次4 h。

　　2.8.2醇沉浓度优选结果结果见表4。从结果可以看出熟地多糖最佳醇沉浓度为80%。

　　2.8.3脱蛋白工艺优选结果结果见表5。表4不同醇沉浓度对干膏收率和多糖吸收度的影响表5不同氯化钙浓度对多糖保存率和蛋白脱除率的影响

　　2.8.4熟地黄粗多糖提取、纯化工艺验证试验结果收膏率和干膏中多糖含量见表6。表6工艺验证性试验结果

　　3讨论

　　实验中，将一定浓度葡萄糖对照品溶液加苯酚、硫酸显色，用紫外可见分光光度计在400～550 nm范围内进行波长扫描，结果在488 nm处有最大吸收。将蛋白对照品溶液加显色剂后进行全波长扫描，在494 nm处有最大吸收。

　　本实验首次采用无水氯化钙对熟地黄粗多糖进行脱蛋白，操作简便，经济无毒，适用于工业化生产。无水氯化钙脱蛋白是利用盐析的原理[7]，蛋白质在高浓度的盐溶液中，随着盐浓度的逐步增加，蛋白质水化膜破坏，溶解度下降而从溶液中沉淀出来。最佳脱蛋白效果仅有50.54%，可能大量的蛋白与多糖结合，这些结合蛋白较难脱除。寻找高效、安全、适合工业生产的脱蛋白方法，仍需进一步探索、研究。

　　本实验选用苯酚-硫酸法测定地黄多糖含量，计算出含量较高，这可能因为粗多糖中含有较多单糖、低聚糖，参与显色，以至吸光度增大。为此进一步研究，按本文中方法进行提取、初步纯化，3批药材熟地黄粗多糖平均得率为35.48%。进一步进行透析(透析袋分子量8 000～12 000)，得率仅有5%左右，这也印证了以上观点。不过本实验仅以含量为指标筛选工艺，误差同等，筛选出来的结果还是科学可行的。

【参考文献】
  　[1]崔瑛，冯静，王辉，等.熟地黄干预小鼠焦虑行为实验[J].中国临床康复，2006，10(43)：61.

　　[2]纪耀华，孙莹，高松红，等.地黄炮制前后总多糖含量的比较[J].中医药信息，1999，16(5):16.

　　[3]陈韩英，李炳奇，刘红，等.熟地多糖的微波提取和含量测定[J].时珍国医国药，2004，15(8):488.

　　[4]李红霞，许闵，孟江，等.怀地黄多糖含量测定[J].河南科学，2002，20(2):144.

　　[5]赵英永，戴云，崔秀明，等.考马斯亮蓝G-250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量[J].云南民族大学学报，2006，15(13):236.

　　[6]黄纯，马驰，宋慧智，等.亮菌多糖提取中脱蛋白和脱色方法比较[J].药学与临床研究，2007，15(1):46.

　　[7]郝少莉，仇农学.沉淀分析技术在蛋白质处理方面的应用[J].粮食与食品工业，2007，14(1):20.