川芎嗪对大鼠膜性肾病防治作用的实验研究

           作者：谭宗凤 罗光燕 孙兴旺 曹灵 梁静 周万洪 邹德平

【摘要】  目的探讨川芎嗪对阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA) 诱导的大鼠膜性肾病的防治作用和机制。方法将30只SD雄性大鼠随机分为：正常组，模型组，川芎嗪预防治疗组。除正常组外，其余两组均按改良Border(1)法复制膜性肾病大鼠模型，川芎嗪预防治疗组加用川芎嗪进行干预治疗。正式免疫第4周末取大鼠肾组织进行光镜、电镜及免疫荧光检测;取尿和血液检测尿蛋白定量，血清白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血肌酐、尿素氮以及内生肌酐清除率的情况。结果川芎嗪组肾小球上皮下电子致密物沉积明显减少，肾脏病理损害较模型组明显减轻;川芎嗪组血肌酐、尿素氮水平与模型组比较显著降低(P<0.05),而血清白蛋白水平与模型组比较显著升高(P<0.05)，24 h尿蛋白定量、胆固醇、甘油三酯与模型组比较降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论川芎嗪可能通过减少肾小球上皮下免疫复合物的沉积、减轻足细胞损伤、抑制肾小球基底膜增厚及降低血肌酐、尿素氮水平而对肾功能起保护作用。

【关键词】  阳离子化牛血清白蛋白;川芎嗪;膜性肾病

　膜性肾病(Membranous nephropathy，MN)是一种常见的肾小球疾病，其主要的病理改变是肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)上皮下免疫复合物沉积伴GBM弥漫性增厚，其临床表现为大量蛋白尿或者肾病综合征，常有髙凝状态存在。目前西医对MN的治疗以激素和细胞毒药物为主，辅以肝素、潘生丁抗凝、抗血小板治疗，但存在较大的副作用和疗效的不确定性[1]。川芎嗪又名四甲基吡嗪，为中医活血化瘀的代表用药川芎的有效成分提取物，具有扩张血管，改善微循环，抑制血小板聚集，抑制细胞增生，抗氧化、抗纤维化，抗细胞凋亡等药理作用，多年来广泛用于肾脏疾病的治疗并取得了较好的疗效[2]。故本实验用川芎嗪干预治疗大鼠MN，并探讨川芎嗪对大鼠MN的防治作用及其可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂天然牛血清白蛋白、4 mol/L醋酸缓冲液(pH=4.75)、无水乙二胺(EDA)(购自国药集团化学试剂成都有限公司)，羊毛脂、液体石蜡、碳化二亚胺(EDC)(购自厦门星隆达化学试剂公司),川芎嗪注射液(购自北京双鹤制药厂)。

　　1.2 动物及分组清洁级SD大鼠30只，雄性，健康，体质量100～150 g，由泸州医学院动物中心提供;大鼠适应性喂养7 d，尿蛋白定性为阴性者纳入实验，将动物随机分为3组：正常组、模型组、川芎嗪预防治疗组,每组10只。

　　1.3 C-BSA肾炎模型制作用改良Border法[3]，通过连续4周隔日尾静脉注射C-BSA(16 mg/kg)制作大鼠膜性肾病模型。自正式免疫第1周起，正常组和模型组每日腹腔注射2 ml生理盐水，川芎嗪组每天腹腔注射等体积生理盐水稀释的川芎嗪注射液(100 mg/kg)。

　　1.4 观察指标正式实验第1～4周末，准确收集24 h尿检测尿蛋白量。于正式免疫第4周末处死大鼠。处死前大鼠称重，并准确收集24 h尿和血液，检测24 h尿蛋白、尿肌酐和血肌酐、尿素氮、白蛋白、胆固醇、甘油三酯,按公式计算内生肌酐清除率[4];取肾组织用4%多聚甲醛固定液及2.5%戊二醛固定液固定后，进行包埋，切片作光镜、免疫荧光及透射电镜扫描检查鉴定成模情况，观察肾脏病理学改变的情况。

　　1.5 统计学处理采用SPSS14.0统计软件，数据资料皆用±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

　　2结果

　　2.1 肾组织学检查光镜：在HE、PASM、Masson染色下，4周末时，正常对照组基底膜不增厚，上皮细胞形态正常，系膜细胞及基质无增殖，肾小管、肾间质无异常，PASM、Masson染色无异常。模型组大鼠肾组织肾小球肿大，球囊腔较狭窄，毛细血管血栓形成较多，Masson染色可见肾小球毛细血管壁呈均匀一致性增厚，部分上皮下可见嗜复红蛋白沉积(见图1)，PASM下可见GBM外侧可见典型的“钉状突起”，肾小球系膜细胞可见轻度增生(见图2);与模型组比较，川芎嗪组肾小球肿大，球囊腔狭窄均不明显，GBM增厚较轻，肾小球系膜细胞增生不明显。a-为正常组b-为模型组c-川芎嗪组，由图可见模型组GBM增厚明显，部分呈现“双轨征”，GBM上皮下可见嗜复红蛋白沉积，肾小球囊腔狭窄，川芎嗪组肾脏病理改变明显减轻图1各组Masson染色比较a-为正常组b-为模型组c-为川芎嗪组,由图可见模性组GBM增厚，部分可见上皮下“钉状突起”形成图2各组PASM染色比较电镜：模型组在4周末时，可见GBM增厚明显，肾小球上皮细胞肿胀，足突相互融合，部分足突变平或消失，肾小球上皮下有大量电子致密物沉积，GBM上皮侧伸出突起形成光镜下所见的钉突，部分肾小球可见钉突顶部融合，出现双层梯状结构。川芎嗪组肾小球毛细血袢开放，内皮细胞分布均匀，基底膜电子致密物沉积较少，上皮细胞肿胀不明显，足突清晰部分可见融合(见图3)。a-为正常组b-为模型组c-为川芎嗪组,由图可见模型组肾小球足突广泛融合，GBM增厚明显，肾小球上皮下大量电子致密物沉积，内皮细胞胞浆疏松，川芎嗪组肾脏病变明显减轻。　　△为沉积的电子致密物图3各组电镜下病理改变免疫荧光：模型组和川芎嗪组均可见IgG沿肾小球毛细血管壁和部分系膜呈颗粒状沉积，模型组荧光强度为“++～+++”;川芎嗪组荧光强度为“+～++”。正常组肾小球毛细血管壁未见明显荧光(见图4)。a-为正常组b-为模型组c-为川芎嗪组,由图可见模型组IgG沿肾小球毛细血管壁和部分系膜呈耀眼的颗粒状弥漫性沉积，部分因相互融合而呈斑块状，川芎嗪组IgG强度明显减弱，正常组未见明显荧光图4各组免疫荧光比较