DNA条形码在蛤蚧真伪品鉴定中的前景
2.2蛤蚧DNA条形码鉴定
2.2.1DNA条形码在蛤蚧鉴定中的优势
标准、快速、稳定是中药鉴定未来发展的必然趋势，而将DNA条形码识别技术用于中药鉴定正是契合了这一要求。陈士林等[34]对DNA条形码技术的引入中药材鉴定进行了介绍，对DNA条形码的特点，在中药鉴定中的应用及前景和存在的问题进行了陈述。DNA条形码技术相比较于现有的鉴定方法具明显优势(见表1)。
对比上述主要鉴定方法，DNA条形码识别技术的优势主要体现在：①准确：特定的物种具有特定的DNA短片段序列信息，而形态鉴别特征常有的趋同和变异会导致真伪品鉴定误差。②非专家鉴定：由于DNA技术是可机械重复的，可设计一套简单实验技术，经过简单培训的技术员则可操作。这样的工作可投放到基层单位，以解决缺乏专业技师带来的尴尬。③所检对象无组织材料特异性：同一个体的不同组织材料来源的DNA序列信息是一致的。实际工作中，所需检定的中药产品形式往往多种多样，化学成分含量也大相径庭。④所检对象无生活周期的特异性：同种生物的DNA序列信息在不同的生命周期是相同的，所以该技术检测对象可以是生物生命过程中的每一时期，较之传统的方法常需要成体为对象而扩大了检测范围。⑤大量、迅速：可通过建立DNA条码数据库，利用网络传输、试剂盒、基层单位简单的实验室等，一次快速鉴定大量样本。⑥基于标准DNA序列片段为基础，鉴定过程能够实现自动化和标准化。
现有的DNA条形码项目主要针对动物类群，在鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类均已开展，因此将DNA条形码技术用于蛤蚧真伪品的鉴定中的方法和技术已日趋成熟。蛤蚧及其伪品均属于爬行或两栖动物，COI序列在这些类群中已能有效的区分物种，不需再研究探索基因组中更适合DNA条形码的DNA序列;其通用引物序列可参考在脊椎动物中已有的相关研究[35，36]。
DNA条形码技术最初是通过比较动物线粒体COI序列的遗传距离而提出，用COI序列在动物类中药材的鉴定相比植物类中药材鉴定序列有明显优势。植物中DNA条形码的研究进展相对缓慢，目前尚处于对所提议的各片段比较和评价阶段，还未获得一致的标准片段。由于植物线粒体DNA碱基置换速率低，因此线粒体COI基因不能作为植物DNA条形码技术的候选基因。提议的编码基因片段主要有rpoB，rpoCl，matK，rbcL，UPA，非编码区片段有trnH-psbA，atpF-atpH，psbK-psbl，此外还有核基因ITS，已有的研究表明以上任何一个单片段都还不足以区分所有植物物种，因此植物类中药材的DNA条形码鉴定尚需探讨[37，38]。
2.2.2DNA条形码在蛤蚧鉴定中的应用前景
2.2.2.1蛤蚧真伪品鉴定DNA条形码数据库为了蛤蚧真伪品鉴定的规范和标准化，可专门建立蛤蚧真伪品DNA条形码数据库。DNA条形码数据库中可收录蛤蚧及相关伪品的形态特征，生物学特性，药效和DNA条形码序列等信息，并建立联网检索查询、序列比对系统。通过数据库的构建，可将待检样品条形码序列信息与数据库中已知信息进行比对分析，从而达到真伪品识别的目的。同时，借助于该数据库可以迅速的查阅检测样品的相关信息。针对蛤蚧真伪品专有DNA条形码数据库的建立可使这些查询、比对、甄别等过程更加简便、快捷。
2.2.2.2基于DNA条形码序列的鉴别方法展望
DNA 条形码识别技术的核心部分是找到能区分各物种序列片段，以及为所有物种的这段序列进行编码。含有所有物种编码序列的资料源在物种鉴定中是重要的数据信息，因此可基于DNA条形码序列本身，而设计出一些更简捷的鉴定方法。 针对蛤蚧及其伪品DNA条形码序列设计特异性扩增引物，通过PCR特异扩增的方法达到鉴别的目的。这种DNA分子标记中特异引物鉴别的方式，以其利用了在物种鉴定上更具意义的COI序列设计的引物，比使用其他序列片段来设计引物的实用性和可推广性更高。随着DNA条形码识别技术逐步深入，可将其与基因芯片技术相结合达到更快速，高通量的鉴定要求[39，40]。DNA条形码与基因芯片技术相结合可形成一种新的分子鉴定方法——DNA条形码芯片(DNA barcoding chips)。DNA条形码芯片是在DNA条形码序列分析基础上，针对其变异位点，分别设计特异性探针，探针经固化于DNA芯片片基上制作成芯片。通过样品PCR产物与芯片探针特异性杂交和荧光杂交检测分析，达到鉴定的目的。DNA条形码芯片技术可为中药材鉴定提供快速、高通量的检测工具。中药材蛤蚧鉴定的目的是应用快速、低成本、灵敏准确的成套规范化检测技术来确保药材的监管及市场的稳定，而DNA条形码识别技术正是在这种应用的需求下应运而生。DNA条形码识别技术为中药材真伪鉴定标准化、自动化提供了技术支持，将为中药鉴定市场迎来一场新的技术革新。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2005.
[2]袁经权,李力.黑点蛤蚧与红点蛤蚧的本草考证[J].中药材,2008,31(9):1437.
[3]朱华,任仁安.18种商品蛤蚧原动物及性状的鉴别[J].中药方剂,1998,22(1):39.
[4]王纯玉.蛤蚧及其伪品的鉴别[J].中国药业,2003,12(11):64.
[5]孙玉锋,韩红霞.蛤蚧的真伪品种鉴别研究[J].中医中药,2007,45(4):69.
[6]林英,方瑜雯.蛤蚧的真伪鉴别[J].时珍国医国药,2006,17(7):1253.
[7]陈月娥,姚小华. 中药鉴定新技术的发展概况[J].广州中医药大学学报，2007,24(4):346.
[8] 谢志民,王铀,王云霞.近年来中药材造假、掺假现象剖析[J].中国药事,2004,18(2):77.
[9]朱华,林冬杰,莫小玲,等.广西蛤蚧、泰国蛤蚧及其混伪品海蛤蚧(红瘰疣螈)的生药鉴定[J].广西中医药,1997,20(6):34.
[10]侯丽光.中药蛤蚧鉴别分析[J].黑龙江中医药,2004，3:35.
[11]廖汉成,王实强,杨瑛,等.蜈蚣全蝎蛤蚧3种动物中药超微饮片的薄层鉴别[J].湖南中医杂志,2003,19(6):54.
[12]王丽娟,左壮,张洁,等.蛤蚧及其伪品的微量元素测定和鉴定意义[J].动物药研究,1990,13(6) :9.
[13]朱志峰,王树春,刘旭英,等.中药材蛤蚧的X衍射Fourier谱分析[J].中草药,2001,32(10): 932.
[14]Joshi, K., Chavan, P., Warude, D.,et al. Molecular markers in herbal drug technology [J].Current Science ,2004,87(2): 159.
[15]Fan, X.H., Cheng, Y.Y., Ye, Z.L., et al. Multiple chromatographic fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicines [J].Analytica Chimica Acta ,2006, 555(2): 217.
[16]刘训红,王春根,喻向华.蛤蚧及其伪品的等电点鉴别[J].中药材,1991,14(10):24.
[17]刘训红,王春根,陈彬. 蛤蚧及其伪品的粘度鉴别[J].中药材,1992 ,15(8):20.
[18]鞠爱华,杨来秀,青梅,等. 蛤蚧及其伪品的蛋白电泳鉴别[J].中国中药杂志,1994,19(1):9.
[19]芮代莉,滕茜华,梁秀云,等. 乙酸纤维素薄膜电泳鉴别蛤蚧及其伪品[J].中药材,1994,17(2):23.
[20]秦新民,梁燕妮,黄夕洋.3个地理种群蛤蚧不同组织同工酶分析[J].广西科学,2006,13(4):310.
[21]徐红, 王峥涛, 胡之壁. 中药dna分子鉴定技术的发展与应用[J]. 世界科学技术-中医药现代化，2003, 5(2):24.
[22]秦新民,梁燕妮,黄夕洋,等. 不同地理区域蛤蚧的RAPD 分析[J].动物学杂志,2005,40(6):14.
[23]Sucher, N.J.,Carles, M.C.. Genome-based approaches to the authentication of medicinal plants[J].Planta Medica ,2008,74(6): 603.
[24]张月云,莫新春,曾维铭,等.从12SrRNA基因序列差异分析黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的进化关系[J].广西医学,2006,28(6):793.
[25]韩德民,周开亚,王义权. 从12S rRNA 基因序列探讨中国10 种壁虎的系统关系[J]. 动物学报,2001,47(2):139.
[26]秦新民,钱芳,曾振华. 红斑大壁虎与黑斑大壁虎细胞色素b基因序列差异与分化[J].安徽农业科学,2009,37(14):6383.
[27]韦素玲,曾振华,李翠凤,等. 5 种壁虎科动物Cyt b 基因的序列分析[J].安徽农业科学,2008,36(6):2268.
[28]Liu Z Q, Wang Y Q, Zhou K Y, et al. Authentication of Chinese Crude Drug, Gecko, by Allele-Specific Diagnostic PCR[J].Planta Med, 2001, 67(4):385.
[29]Hebert PDN, A Cywinska , SL Ball , et al. Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc. R. Soc. Lond. B., 2003, 270:313.
[30]Hebert PDN, Ratnasingham S, Dewaard J R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proc. R. Soc. Lond. B., 2003,270 :S96.
[31]Remigio E A., Hebert P D N. Testing the utility of partial COI sequences for phylogenetic estimates of gastropod relationships[J].Mol. Phylogenet. Evol., 2003,29:641.
[32]Avise J C. Phylogeography : the History and Formation of Species[J]. London: Harvard University Press, 2000.
[33]Gregory T R.. DNA barcoding does not compete with taxonomy[J].Nature, 2005,434(7037):1067.
[34]陈士林, 姚辉, 宋经元, 等. 基于DNA barcoding(条形码)技术的中药材鉴定[J].世界科学技术-中医药现代化, 2007，9(3):7.
[35]Vences, M., Thomas, M., Bonett, R.M.,et al. Deciphering amphibian diversity through DNA barcoding: chances and challenges[J].Proc. R. Soc. Lond. B. ,2005 ,360(1462):1859.
[36]Hebert P.D.N., Stoeckle M.Y., Zemlak T.S.,et al. Identification of birds through DNA barcodes[J].Plos Biology， 2004, 2(10): 1657.
[37]Kress, J. W., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., et al., Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A ,2005,102(23): 8369.
[38]宁淑萍,颜海飞,郝刚,等.植物DNA条形码研究进展[J].生物多样性,2008,16(5):417.
[39]Hajibabaei, M., Singer, G.A.C., Clare, E.L.,et al. Design and applicability of DNA arrays and DNA barcodes in biodiversity monitoring[J]. Bmc Biology， 2007，5：24.
[40]赵明, 谭玲, 莫帮辉, 等. DNA条形码识别Ⅲ.媒介蚊类dna条形码芯片的初步研究[J].中国媒介生物学及控制杂志, 2008,19(2): 99.