酶解法提取长春花中长春碱、长春质碱、文多林

　　2.4  提取方法精密称取一定量的长春花粉末，在不同的浸提倍数、不同的pH、不同的温度和纤维素酶下酶解不同的时间后，过滤，滤液加氨水调pH值至8.0。用四氯化碳多次萃取，合并萃取液，挥干。残渣加甲醇溶解，定容。上样前经0.45 μm微孔滤膜过滤。

　　3  结果与讨论

　　3.1  酶解温度对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，浸提倍数20，pH 1.5，纤维素酶2 mg/g(以长春花粉末重量为基数，下同)，酶解时间12 h，温度分别选取30，35，40，45，50℃。

　　在酶解反应中，温度既能改变酶反应本身的速度，也能导致酶蛋白变性失活。在一定的范围内，温度升高，反应速度加快，但温度超过一定程度时，又促进了酶蛋白的变性反应，使催化能力降低。因此，所有的酶反应都有一个最适温度或温度范围。当温度升高，长春碱、长春质碱和文多林的提取产率增大；但达到40℃后继续升高温度，长春质碱和文多林的提取产率增速趋缓，而长春碱提取产率反而下降(见图2)。这是因为长春碱在50℃以上开始分解氧化。因为在3种长春花生物碱中以长春碱的经济价值最高，因此，纤维素酶解长春花的最适温度选定为40℃。

　　3.2    酶解时间对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，浸提倍数20，pH1.5，纤维素酶2 mg/g，温度40℃，酶解时间分别选取为6，8，10，12，14 h。
   
　　在酶解初始pH值、酶解温度和酶量一定的条件下，随反应时间的延长，长春质碱和文多林的提取产率逐渐提高，12 h后达到最大值；长春碱的提取产率也随时间的延长提取产率逐步提高，但长春碱比长春质碱和文多林更难溶出，需经长时间的浸泡(见图3)。这是因为随着时间的延长，纤维素酶与植物细胞得到充分结合，酶活力得到充分利用，酶解反应进行得较完全。但当提取产率达到一定值后，酶解反应时间的延长并不能增大提取产率，反而会浪费能耗。因此，最佳的酶解时间为12 h。

　　3.3  酶解pH对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，浸提倍数20，纤维素酶2 mg/g，酶解温度40℃，酶解时间12 h，选取pH的范围为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0。
   
　　酶是两性化合物，分子中含有许多羧基和氨基基团，因此酶反应需在一定的pH值条件下进行，过酸或过碱既影响酶的稳定性，也直接影响酶的催化活性。试验结果表明，在其它条件一定的情况下，当pH值为1.5时，长春碱、长春质碱和文多林的提取产率最高(见图4)。

　　3.4  酶用量对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，浸提倍数20，pH 1.5，酶解时间12 h，酶解温度40℃，加纤维素酶的量为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/g。
   
　　实验结果显示，在反应体系其它因素不变的情况下，长春花各碱的提取产率先随着酶用量的增加而增大，但继续增加酶用量，提取产率反而有下降的趋势(见图5)。原因在于，随着酶量的增加，纤维素酶与纤维素分子的接触机会增加，在一定时间内，致使长春碱、长春质碱、文多林更多的溶出；达到最大值后，随着加酶量的增加，底物被酶分子所饱和，纤维素被水解的速度趋于稳定，致使长春碱、长春质碱和文多林的提取产率也趋于稳定。因此，纤维素酶的最佳加入量为2 mg/g。

　　3.5  浸提倍数对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，pH 1.5，酶解时间12 h，酶解温度40℃，加纤维素酶的量为2 mg/g，浸提的倍数为8，12，16，20，24。
   
　　随着浸提倍数的增加，反应体系中纤维素酶的浓度会被稀释，纤维素酶与植物细胞壁纤维接触的几率下降，抑制了纤维素酶的水解反应。如图6所示，最佳的浸提倍数为20。

　　3.6  酶法提取与酸水浸提效果比较

　　3.6.1  酶法提取精密称取长春花粉末20 g，加入20倍pH 1.5的酸水，30 min后加入纤维素酶2 mg/g，于40℃条件下酶解12 h；过滤，滤液加氨水调pH值至8.0。用四氯化碳多次萃取，合并萃取液，挥干。残渣加甲醇溶解，定容。上样前经0.45 μm微孔滤膜过滤。

　　3.6.2  酸水浸提精密称取长春花粉末20 g，加入20倍pH1.0的酸水，30 min后置于40℃条件下浸提12 h；过滤，滤液加氨水调pH值至8.0。用四氯化碳多次萃取，合并萃取液，挥干。残渣加甲醇溶解，定容。上样前经0.45 μm微孔滤膜过滤。结果见表1。表1  两种提取工艺的长春碱、长春质碱和文多林的提取产率（略）

　　4  结论
   
　　通过单因素实验得出纤维素酶酶解长春花的最佳工艺为：浸提倍数为20，温度40℃，时间12 h，pH 1.5，加酶量2 mg/g。与酸水浸提法比较，长春碱、长春质碱和文多林的提取产率有了较大幅度的提高。而是否应该进行正交实验进一步优化提取条件有待进一步的验证。
   
　　酶法提取中先加入pH 1.5的酸水30 min后，再加入纤维素酶，目的是通过长春花中的生物碱来中和酸水的pH值，使其达到纤维素酶酶解长春花的最适pH值范围3.5～4（纤维素酶的最适pH值为3.5～5.5），从而达到酸水和纤维素酶共同软化、分解纤维素、破坏细胞壁、增加细胞溶出量的目的。
  
　　长春碱为目前应用最为广泛的抗肿瘤药物之一，主要是从天然植物中提取，但仅从长春花中提取长春碱远不能满足日益增长的市场需求。因此，应充分利用现代提取分离技术来提高长春碱的提取产率。而酶处理技术能较大幅度提高药物有效成分的提取产率，且酶处理技术是在传统的中药提取基础上进行的，对设备无特殊要求，应用常规的提取设备即可完成。因此酶法提取长春碱对长春碱的工业生产有一定的实用意义。

【参考文献】
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