养心通脉有效部位方动员心肌梗塞大鼠MSCs归巢及对心功能和病理的影响
3 结果
3.1 大鼠的在体心功能测定apr-YTF组的心功能4个指标较模型组均有显著改善（P＜0.01），LVSP、 LVEDP、+dp/dtmax和香丹组比较，差异具有显著性意义（P＜0.05或P＜0.01），LVSP较rhG-CSF组显著升高（P＜0.01）；rhG-CSF组的心功能4个指标较模型组均有显著改善（P＜0.05或P＜0.01）；香丹组的+dp/dtmax和模型组比较显著上升（P＜0.01）。结果见表1。表1 各组间心功能的比较(略)
3.2 心肌组织的病理变化apr-YTF组和rhG-CSF组的心肌梗塞边缘区瘢痕组织内可见新生的心肌细胞和血管，恢复的趋势较为明显，而模型组和香丹组的心肌梗塞边缘区瘢痕内则很少见。结果见图1。
3.3 大鼠心室肌瘢痕面积百分比apr-YTF组和rhG-CSF组的心室肌瘢痕面积百分比较模型组和香丹组显著减小（P＜0.01）。结果见表2。
3.4 心肌组织中的CD34+细胞大鼠apr-YTF组和rhG-CSF组的心肌梗塞边缘区胞浆CD34+染色阳性的细胞数均显著高于模型组（P＜0.01），亦高于香丹组（P＜0.05或P＜0.01）；apr-YTF组和rhG-CSF组之间比较，差异具有显著性意义（P＜0.01）。结果见表2。
3.5 心肌组织中Brdu与cTn I双染阳性细胞大鼠apr-YTF组和rhG-CSF组的心肌梗塞边缘区中Brdu与cTn I双染阳性的细胞数均显著高于模型组和香丹组（P＜0.01）；apr-YTF组和rhG-CSF组之间比较，差异具有显著性意义（P＜0.01）。结果见表2及图2。表2 各组间心室肌瘢痕面积百分比、梗塞边缘区胞浆CD34+染色阳性的细胞数、Brdu与cTn I双染染色阳性的细胞数比较(略)
4 讨论
MSCs具有保持未分化特性并无限增殖的能力，并且能够分化为包括心肌细胞在内的各种类型的细胞［7］。在急性心肌缺血状态下MSCs可以通过血液循环自行迁移到心肌损伤部位，参与坏死心肌组织的修复与再生，但由于归巢于心肌梗塞区的MSCs数量极少，其自我修复的作用也就极为有限［8］。因此，寻找能高效提高外周血液中MSCs的数量，并动员其定向归巢于损伤心肌的MSCs动员剂，成为一种迫切需要。Fukuhara等［9］ 利用rhG-CSF的动员作用，将小鼠骨髓细胞进行绿色荧光蛋白标记，分别于梗塞前3 d至梗塞后5 d给予rhG-CSF干预，结果发现，骨髓来源的绿色荧光蛋白标记的骨髓细胞部分呈现心肌细胞特异标志肌钙蛋白阳性。CD+34细胞是MSCs的特征性标志之一。
本研究发现大鼠apr-YTF组和rhG-CSF组的心肌梗塞边缘区胞浆CD34+染色阳性的细胞数均显著高于模型组（P＜0.01），且两组之间的差异没有显著性意义（P＞0.05），提示apr-YTF具有和rhG-CSF相似的促进MSCs归巢于梗塞心肌的功能。
瘢痕形成是机体创伤修复的必然产物，当机体组织受到一定深度的损伤后，创面先出现炎症反应，白细胞、巨噬细胞、肥大细胞等浸润，释放出多种细胞因子（生长因子），成纤维细胞和肌成纤维细胞大量增生并合成大量的胶原和基质，造成胶原代谢与排列的异常，异常基质的沉着，加上微循环和自由基因素的影响，促进了瘢痕的形成。心肌梗塞瘢痕区意味着没有成活的心肌细胞，也就丧失了正常心肌的功能。apr-YTF组和rhG-CSF组大鼠的心肌梗塞边缘区瘢痕组织内可见新生的心肌细胞和血管，较模型组大大加快了梗塞心肌的修复，因此从病理来看，瘢痕组织区域相应的比模型组要小，且两组之间的差异没有显著性意义（P＞0.05）。
BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，用免疫细胞化学染色就可观察BrdU在细胞内的掺入情况，故BrdU标记法的标记率高，检测准确性高，方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标［10］。肌钙蛋白（cTn）是与心肌和骨骼肌收缩有关的调节蛋白，调节肌肉的收缩和舒张。cTn I仅在新生儿出生9个月之后在心肌中表达，而不在骨骼肌中表达，因此cTn I是心肌特异的抗原，具有优越的心肌特异性。因此，检测心肌梗塞区中Brdu与cTn I双染阳性的细胞能提示为MSCs归巢后转化为处于分化增殖状态的心肌细胞。apr-YTF组和rhG-CSF组大鼠的心肌梗塞区的双染阳性细胞数较模型组显著增多（P＜0.01），同样提示apr-YTF和rhG-CSF一样具有相似的促进MSCs归巢于梗塞心肌并转化为心肌细胞的功能，且两组之间的差异没有显著性意义（P＞0.05）。
心肌细胞在缺血后可发生坏死和凋亡，一定面积的梗塞导致心功能下降。LVSP、+dp/dtmax是衡量心肌收缩能力和损伤程度的最常用指标，-dp/dtmax及LVEDP反映左心室舒张期顺应性和心肌僵硬度。apr-YTF组和rhG-CSF组大鼠的心功能4个指标较模型组均有显著改善，且apr-YTF组的LVSP较rhG-CSF组显著升高（P＜0.01），显示apr-YTF和rhG-CSF均具有改善急性心肌梗塞大鼠心功能的作用。无疑，促进心肌细胞再生，恢复梗塞心肌，缩小瘢痕是其重要的机制之一。由于rhG-CSF治疗急性心肌梗塞的原理在于动员MSCs归巢，促进血管和心肌细胞再生，而apr-YTF在动员MSCs归巢和改善心肌病理、心功能方面具有与rhG-CSF一致的功效，因此作者认为动员MSCs归巢是apr-YTF取得疗效的主要机制之一。
养心通脉方，由人参、丹参、枳实、泽泻、桂枝等按一定比例组成，方中人参补已虚之元气，丹参活血化瘀，枳实理气消痰，泽泻利水而补阴不足，桂枝温经通脉，处方配伍可谓主次分明，切中本虚标实（尤其是气虚血瘀）的急性心肌梗塞病机。apr-YTF是由养心通脉方中提取出人参皂苷、丹参酮ⅡA、总生物碱、人参多糖、复方多糖、总挥发油等有效部位按一定比例组成的。根据参考文献［11～14］，本实验造模的大鼠具有急性心肌梗塞心血瘀阻证的中医证候特点，作者也观察到造模过程中有梗塞心肌的心脏变苍白，搏动无力，因此实际上具有微观辨证“气虚血瘀”的证候特点，而apr-YTF恰具有改善此证候实质的良好作用，具有行气活血作用的香丹注射液则远远不及益气活血的本方。
【参考文献】
［1］陈清华，莫 莉，袁肇凯，等.养心通脉方有效成分部位抗心肌缺血的实验研究［J］.中华中医药学刊，2008，26（9）：1910.
［2］袁肇凯，陈清华，黄献平，等.养心通脉方有效成分部位的最佳剂量配伍抗急性心肌缺血的研究［J］.湖南中医药大学学报，2008，28（6）：21.
［3］Keller G.Embryonic stem cell differentiation:emergence of a new era in biology and medicien［J］.Genes Dev，2005，19:1129.
［4］袁肇凯.中医诊断实验方法学（第2版）［M］.北京:科学技术出版社，2006：257.
［5］汪进益，范慧敏，刘中民.建立适用于细胞移植研究的大鼠心肌梗死动物模型［J］.上海医学，2007，30（增刊）：63.
［6］Li RK，Mickle DA，Weisel RD，et al.Optimal time for cardiomyocyte transplantation to maximize myocardial function after left ventricular injury［J］.Ann Thorac Surg，2001，72(6):1957.
［7］Hung SC，Chen NJ，Hsieh SL，et al.Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow［J］.Stem Cells，2002，20(3):249.
［8］J.F. Bentzon, K. Stenderup, F.D. Hansen,et a1．Tissue distribution and engraftment of human mesenchymal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene［J］.Biochem Biophys Res Commun,2005,330(3):633.
［9］Fukuhara S，Tomita S，Nakatani T，et a1．G-CSF promotes bone marrow cells to migrate into infarcted mice heart，and differentiate into cardiomyocytes［J］.Cell Transplant，2004，13(7)：741.
［10］张本斯，李 庄，杨新文，等.BrdU标记骨髓间充质干细胞的研究［J］.大理学院学报，2007，6（2）：23.
［11］袁肇凯.中医诊断实验方法学（第2版）［M］.北京:科学技术出版社，2006：257.
［12］汪进益，范慧敏，刘中民.建立适用于细胞移植研究的大鼠心肌梗死动物模型［J］.上海医学，30（增刊）：63.
［13］陈世宏，叶 耘，尚正录，等. 不同治法对大鼠心肌缺血模型中医证型的反证研究［J］. 上海中医药大学学报，2005，19（4）：36.
［14］王 佳.大鼠“血瘀证”下急性心肌梗死模型的建立和评价［D］.吉林大学硕士论文，2007.