中药研究与开发

　　2.4.2  操作过程 

　　制备50 mL培养基,灭菌30 min。在超净工作台上,先倒出30 mL至培养皿中,再于50 ℃左右向另外20 mL培养基中迅速加入0.6 mL菌悬液,混匀,倒入同一个培养皿中。待培养基凝固后,分别点上5 μL、浓度为6 mg/mL的各提取物溶液。在37 ℃恒温培养箱中培养10 h,然后进行美蓝染色。量取100 mL 95 %乙醇,加浓盐酸1滴,即为酸性乙醇。量取100 mL 95%乙醇,加氢氧化钠2 g,振摇,待溶解后即为碱性乙醇。取美蓝溶液20 mL倒入平板中,用三角耙涂匀,2 min后倾去,倒入酸性乙醇20 mL,2 min后倾去,倒入碱性乙醇20 mL,2 min后倾去。细流自来水冲洗3 min,倾去并吸干浮水,快速贴上滤纸1张,用三角耙赶走气泡,10 min后揭下滤纸,晾干。5种游离蒽醌抑菌圈直径：大黄酸为5 mm,大黄素为9 mm,芦荟大黄素为3 mm,大黄酚与大黄素甲醚混合物为0 mm。

　　2.4.3  二分法测定各提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度[3] 

　　准备16支试管,其中1支作为空白对照组,其余15支平均分成3组,分别代表3种不同的成分,每组分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号,并用记号笔标明。然后用相应的缓冲液配制成不同浓度的提取物溶液,向试管中加入培养基(配方与2.4.1相同,但不加琼脂),将培养基与提取物溶液充分混合后,灭菌。最后在超净工作台上分别向3组试管中(除空白对照组)分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液。具体加入量见表1～表3。培养24 h酸的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号试管全部长菌,只有Ⅰ号试管没有长菌；芦荟大黄素的情况与大黄酸一样,只有Ⅰ号试管没有长菌。大黄素的抑菌作用最好,Ⅰ、Ⅱ管都没有长菌,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号试管全部长菌表1  大黄酸不同浓度溶液的抑菌作用（略）表2  大黄素不同浓度溶液的抑菌作用（略）表3  芦荟大黄素不同浓度溶液的抑菌作用（略）
　
　　3  讨论

    二分法具有简便、准确、省时等特点。将待测成分按其前一个的一半浓度稀释,首先在数值计算上很方便,不用大量的计算；其次在配溶液时不容易弄乱出错,只进行稀释半倍即可；第三是在做出结果后,直接用肉眼就可以观察结果,方便快捷,无须动用其他仪器,节省时间。实验结果表明,大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸有抑菌作用,大黄酚与大黄素甲醚无抑菌作用。抑菌效果大黄素最好,芦荟大黄素次之,大黄酸最差。

【参考文献】
  [1] 张 梅.中药化学基础.北京：化学工业出版社,2006.85.

　　[2] 袁倚盛.大黄游离蒽醌的制备与纯化[J].中草药,2000,31(7)：508.

　　[3] 郑钧镛.药品微生物学及检验技术[M].北京：人民卫生出版社,1989.149.