金银花提取物体外抗甲型流感病毒FM1株的研究

　　2.2  流感病毒增毒及其在鸡胚上半数感染量的测定

　　将病毒原液接种于局部消毒后的9日龄SPF鸡胚尿囊腔,每胚接种0.1 mL,石蜡封口,33～35 ℃温箱孵育48 h,4 ℃过夜。收取尿囊液,红细胞凝集试验测血凝滴度。

　　将流感病毒原液系列对数稀释(10-1～10-12),分别接种在事先标记好的鸡胚尿囊腔内,每个浓度接种4个鸡胚,并做生理盐水对照。将注射了流感病毒的鸡胚放入33～35 ℃温箱内,48 h后取出,放入4 ℃冰箱内过夜；收取尿囊液,每胚0.1 mL依次加入作好标记的血凝板上,再加入预先配制好1%的鸡血球0.1 mL,轻摇后40 min观察结果,用k·rber公式[2]计算。测得EID50为10-6.28,实验用100EID50。

　　2.3  金银花提取物最大不凝血浓度的测定

　　中药中含有植物血凝素,在体外实验中往往引起红细胞凝集,造成假阳性结果。因此,应用血凝试验探讨中药体外抑制病毒作用,必须测定中药的最大不凝血浓度以去除影响因素。处理好的药液从原浓度始,用pH值7.4的Hank,s工作液2倍系列稀释6个浓度：2-1～2-6(400～12.5 mg/mL),分别加入等量固定血凝单位的流感病毒,33～35 ℃温箱中和2 h,测定血凝效价,同时设Hank,s液对照和病毒对照。结果测得金银花提取物不引起血凝的最大浓度为25 mg/mL。

　　2.4  金银花提取物及利巴韦林注射液对鸡胚最大无毒浓度的测定
用含PS 10%的生理盐水将药物原液作连续2倍系列稀释至1∶512浓度,每次抽取0.2 mL分别接种在预先作好标记的鸡胚上,每个浓度接种4个鸡胚,并设生理盐水对照。将接种好的鸡胚放入35 ℃温箱内孵育48 h,每12 h观察记录鸡胚存活情况,24 h内死亡的鸡胚不记入药物毒性作用致死数。金银花提取物的最大无毒浓度为100 mg/mL,利巴韦林注射液最大无毒浓度为50 mg/mL。

　　2.5  金银花提取物不同浓度、不同时间体外抑制病毒作用

　　用pH 为7.4的Hank,s工作液,将金银花提取物溶液从最大不凝血浓度起作系列2倍稀释3个浓度,每个浓度4支试管,分别加入等量100EID50的流感病毒,置33～35 ℃温箱中和1、4、8、14、16、24 h,测各组药物不同浓度、不同时间点血凝效价,同时设病毒对照和Hank,s液对照。

　　2.6  金银花提取物对甲型流感病毒感染鸡胚预防和保护作用

　　2.6.1  预防作用 

　　药物原液自TD0开始2倍比稀释3个浓度(100、50、25 mg/mL),每胚0.1 mL分别接种鸡胚,每个浓度8个鸡胚,37 ℃孵育2 h,并设生理盐水和病毒对照；然后分别接种0.1 mL的100EID50的病毒悬液,放入35 ℃温箱内48 h,再4 ℃过夜。抽取尿囊液,测定血凝滴度。

　　2.6.2  治疗作用 

　　用100EID50病毒悬液接种鸡胚,34 ℃孵育2 h,再分别接种与预防实验同浓度的药液,每组8个鸡胚,并设生理盐水及病毒对照。34 ℃温箱内48 h,再4 ℃过夜。抽取尿囊液,测定血凝滴度。

　　3  结果

　　(见图1,表1～表3)表1  金银花提取物体外直接抑制流感病毒作用(略)表2  不同浓度金银花提取物对流感病毒感染鸡胚预防作用(略)注：与病毒对照组比较,**P<0.001；与病毒唑组比较,#P<0.05（下同）。表3  不同浓度金银花提取物对流感病毒感染鸡胚治疗作用(略)
 
　　在供试样品溶液色谱图中,与对照品溶液色谱图相应的位置上,有一相同保留时间的色谱峰,经计算金银花提取物样品中绿原酸含量为1.76%。
 
　　4  讨论

　　我们的前期实验得出银翘散全方、君药组和臣药组均具有抑制流感病毒在小鼠体内增殖、保护肺组织的作用。单味药金银花提取物抗甲型流感病毒FM1株的体外实验结果表明,该药具有很强的直接杀灭甲型流感病毒FM1株的作用,并且对流感病毒的预防及治疗作用效果显著。

　　绿原酸是金银花的主要药用成分,具有显著的清热解毒和抗菌消炎作用,国家药典也以绿原酸为指标控制含量。本实验采用80%乙醇回流提取方法,去除部分杂质,得到金银花粗提物,并通过样品含量计算,得到金银花抗流感病毒有效部位中绿原酸含量为1.76%,达到药典标准。因此可以推论,绿原酸可能是中药金银花抗流感病毒作用的主要物质基础之一。

【参考文献】
  　　[1] 马丙祥,段晓颖,王志超,等.双花喷雾剂治疗小儿上呼吸道感染临床与实验研究[J].中国中西医结合杂志,2000,20(9)：655.

　　[2] 郭元吉.流行性感冒病毒及实验技术[M].北京：中国三峡出版社, 1997.120.