欧盟草药药品质量标准中杂质检测相关要求
2.3 真菌毒素
真菌毒素(mycotoxins)是指曲霉、青霉、镰刀霉等丝状真菌产生的具有生物毒性的次级代谢产物,如黄曲霉毒素(aflatoxin)、赭曲毒素(ochratoxin)、展青霉素(patulin)。人和动物摄入含有真菌毒素的谷物或食品后,将发生严重的真菌毒素中毒症。例如,《欧洲药典》和《质量规范指南》中专门提及的黄曲霉毒素,分为B1、B2、G1、G2等10多种,尤其以黄曲霉毒素B1为强致癌物质。表2 欧盟食品中真菌毒素的限量规定及标准来源（略）注：“-”表示未列该项。表1 《欧洲药典》中农药残留限量的规定（略）
2.3.1 检测方法
目前,《欧洲药典》中尚未列出真菌毒素的检验方法和具体限量,但在药材总论中指出,必要时应对黄曲霉毒素的限量做出规定[11]。在实际中,药材、草药加工品和草药药品可参照欧盟食品中真菌毒素的相关要求执行。一方面,由于真菌毒素在食品中的分布通常很不均匀,待测样本量、取样方法对结果影响很大,因此在欧盟相关食品法规[12]中,对不同种类食品的取样、试样制备方法作了详尽的规定；另一方面,欧盟食品法规中也并未规定必须采用薄层色谱法、微柱筛选法、酶联吸附免疫法、免疫亲和柱-荧光法、免疫亲和柱-HPLC法等何种具体方法来测定真菌毒素,检测实验室可自行选择适宜的方法,但必须满足方法学上空白对照、回收率、标准偏差、精密度、重现性等方法学考查指标的规定。
2.3.2 限量规定
欧盟食品中真菌毒素的限量及标准来源参见表2[13-15]。值得注意的是,《德国食品黄曲霉毒素污染标准》不仅适用于食品,也适用于草药。因此,对中成药目前申请欧盟传统草药药品注册中制订真菌毒素的标准具有一定参考价值。
2.4 熏蒸剂
熏蒸剂(Fumigants)主要是指可杀灭害虫和虫卵,防止害虫破坏储藏的药材所使用的化学物质,如,甲基溴、磷化氢、氯化苦等,但各种化学熏蒸剂都存在着不同程度的人畜毒性和环境污染。自1989年12月31日以来,欧洲已经禁止使用环氧乙烷熏蒸药材[11]。甲基溴是欧盟目前使用最广泛的熏蒸剂,但由于甲基溴会造成臭氧层的破坏,根据1992年制订的《蒙特利尔议定书》哥本哈根修正案,目前已逐步被淘汰。
《欧洲药典》中尚无熏蒸剂检测方法和限量的规定。HMPC 2006年10月发表了对于熏蒸剂使用的考虑意见[16],目前还不具备法律效力。HMPC建议,尽可能地限制使用熏蒸剂,除非根据实际情况必需时才使用。使用时应注意熏蒸剂的选择和施用的时间长短,并对熏蒸剂毒性及其对生态环境、药材本身的影响进行风险评价。应尽量减小对施药操作人员和消费者的健康危害。对于残留的熏蒸剂还应建立适宜的分析方法、限量。
2.5 微生物
欧盟对药材、草药加工品和草药药品的微生物检验要求是有所区别的。对于药材和草药加工品,微生物指标未作为必须检验指标,但若有必要,其检验方法则须采用《欧洲药典》检验方法[17-18],其微生物限量可参考《欧洲药典》药物制剂的微生物限量相关规定[19]。而对于草药药品而言,则必须遵循《欧洲药典》的微生物检验方法和限量规定。
2.5.1 检验方法
微生物检验包括需氧微生物总数、酵母菌和霉菌总数以及控制菌数(沙门氏菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等)的检验。需氧微生物总数、酵母菌和霉菌总数可采用薄膜过滤法、平板计数法,或者最大可能数计数法(most- probable-number method,MPN法)测定。控制菌的检验需采用选择性培养基培养规定检查的菌株,并进行菌株验证。
2.5.2 限量规定
《欧洲药典》中的制剂分为4类：第1类为无菌制剂；第2类包括局部用制剂、呼吸道制剂(无菌呼吸道制剂除外)和透皮贴剂；第3类分为A和B两个小类：A类为口服和直肠给药制剂；B类为含有天然来源的动植物或矿物质的制剂(但不包括第4类草药药品),B类制剂虽无法进行抗菌预处理,但允许原料的需氧微生物总数超过每克或每毫升5×103个；第4类为由一种或多种完整的、部分完整或打粉的药材组成的制剂,按照使用前是否需加入沸水,再分为A(使用前需加入沸水)和B(使用前不需加入沸水)两个小类。根据传统草药药品给药方式的限制,第3和第4类制剂的微生物限量参见表3。表3 《欧洲药典》第3和第4类制剂的微生物限量规定（略）注：“-”表示未列该项。
2.6 降解产物
《质量规范指南》指出,如果草药药品含有源于药材或其提取物的降解产物(如由羟基蒽苷降解得到的苷元),则需对降解产物进行检测,并制订其可接受的限量。此外,草药药品中如果含有维生素和矿物质,则应控制维生素和矿物质的降解产物,但如果能用实际的数据、适宜的分析方法,表明在具体的组成和特定贮藏条件下,维生素和矿物质不会降解,经批准后,对降解产物的检测可以简化或免做。
2.6.1 检测方法
降解产物的分析检测方法、报告限度、鉴定限度、质控限度需参照欧盟《新药杂质指南》[20]。事实上,该指南并非主要针对草药产品的降解产物,而是针对化学原料药的降解产物、原料药与辅料反应的产物、原料药与直接接触的容器反应的产物。同时,草药药品中含有的维生素、矿物质仍然适用于该指南。由此可以看出,欧盟对草药药品的质量标准仍然借鉴了一部分化学药的标准,并没有放松对产品质量安全性的考虑。根据降解产物性质的不同,可采用化学法、光谱法、色谱法等方法进行检测。
2.6.2 限量规定
根据药物最大日服用量的不同,欧盟药品中降解产物的报告限度、鉴定限度、质控限度规定不同。报告限度(reporting threshold)：超出此限度的降解产物均应在检测报告中报告,并应报告具体的检测数据。鉴定限度(identification threshold)：超出此限度的降解产物均应进行定性分析,确定其化学结构。质控限度(qualification threshold)：质量标准中一般允许的降解产物限度,如制订的限度高于此限度,则应有充分的依据。如果降解产物的毒性较大,应制订其更低的报告限度、鉴定限度、质控限度。参见表4。表4 欧盟药品降解产物限度（略）注：*为报告限度,△为鉴定限度,▲质控限度；“TDI”表示降解产物的每日总摄入量。
2.7 残留溶剂
残留溶剂是指草药加工品和草药药品生产过程中,未完全除去的挥发性有机溶剂。根据溶剂毒性的高低,《欧洲药典》中将溶剂分为4类：第1类为应避免使用的致癌性溶剂；第2类为限制使用的有一定毒性的溶剂；第3类为药品GMP或其他质量要求限制使用的有潜在低毒性的溶剂,如乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸、乙酸乙酯等,第3类溶剂的每日允许安全摄入量(permitted daily exposure,PDE,PDE值大,该溶剂的安全性更高)不得低于50 mg；第4类为尚无足够毒理学资料的溶剂。草药加工品和草药药品生产过程中,如果已对草药加工品进行了适宜的残留溶剂控制,则不需在草药药品中重复检测。但如果是包衣等制剂成型过程中用了其他溶剂,仍需控制该溶剂的残留。
2.7.1 检测方法
第1、2类溶剂(残留限量高于0.1%时)的定量测定需参照《欧洲药典》残留溶剂的通则[21]。由于第3类溶剂在生产工艺中使用非常广泛,用量也很大,其残留问题值得重视。如果只使用了第3类溶剂,可按照干燥失重不超过0.5%的限度控制溶剂残留量,残留限量高于0.5%时要求定性鉴别,并采用气相色谱法定量测定[21-22]。《欧洲药典》采用A、B双色谱系统的静态顶空进样气相色谱法检测残留溶剂,优先采用A系统,B系统通常仅作为检测结果的进一步确认,并附有第1类和第2类溶剂分别在A、B色谱系统条件下的典型色谱图。
2.7.2 限量规定
苯、四氯化碳等第1类溶剂和乙腈、氯仿等第2类溶剂的浓度限量可参见《欧洲药典》。第1类溶剂的浓度限量多在10 ppm以内,第2类溶剂的PDE值一般接近0.1 mg/d,不同溶剂的浓度限量从50 ppm到3 880 ppm不等。未列出第3类溶剂的浓度限量[23]。
3 小结
欧盟高度重视草药药品以及传统草药药品的质量安全性,从上述重金属和砷化物、农药残留、真菌毒素、熏蒸剂、微生物、残留溶剂等杂质方面的要求可以看出,对于这些方面的检验方法和限量规定已经比较清晰和具体。我国中成药申请欧盟传统草药药品注册,在制订杂质方面的质量标准时,应尽量采用《欧洲药典》等规定的法定方法,并符合《欧洲药典》或相关欧盟法规对于杂质的限量要求,同时,还需密切关注欧盟草药药品委员会陆续发布的各种相关的质量指南,如,欧盟已经着手制订专门针对药品的真菌毒素相关规定,草案可能将于2007年公布,以及欧盟可能将在已公布的熏蒸剂使用考虑意见的基础上,出台正式的相关法规。深入了解并努力达到欧盟对于杂质方面的要求,将十分有助于中成药作为欧盟传统草药药品注册成功。
致谢：感谢中国中医科学院中药研究所王智民教授对本文的亲力指导,以及成都地奥制药集团药物研究所青琳森、魏琪同志的支持和帮助。
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