RP-HPLC法测定马兜铃酸含量方法的优化

             作者：杜晓曦,周跃华,路金才,韩娜,周娟,毕开顺

【摘要】  目的 优化高效液相色谱法对马兜铃酸进行含量分析。方法 通过比较不同提取溶剂、不同提取方法,确定较为合理的供试品溶液制备方法。比较不同流动相条件对马兜铃酸含量测定的影响,选择含量分析色谱条件。测定不同波长下的最低检出限度,确定痕量分析条件。结果 供试品溶液制备中以70%甲醇直接加热回流提取,效率优于其他提取方法。做一般含量分析时可以选择流动相为甲醇-1%醋酸水溶液(70∶30)或乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5) (25∶75),250 nm或319 nm作为检测波长。做痕量分析时宜选择流动相为乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)(25∶75),并选择检测波长为224 nm,最小检出量可达0.02 ng。结论 本实验所建立的方法可以准确可靠的进行马兜铃酸含量分析并进行痕量检查。

【关键词】  马兜铃酸；高效液相色谱法；含量测定

    Abstract：Objective To optimize the RP-HPLC procedure for the determination of aristolochic acid. Method Different extraction solvents and methods have been screened to get the most efficient way for sample preparation. The influence of different mobile systems on quantitation were compared to choose an approprate mobile system for determination. Besides, the minimum limits of different detecting waves were measured to give the method to detect trace amount of aristolochic acid. Result Refluxing with 70% methanol was better than other ways in sample preparation. Both methanol-1% acetic acid (70∶30) solution and 0.3% ammonium carbonate solution (pH=7.5)-acetonitrile (75∶25) with wavelength of 250 nm and 319 nm can be used for quantitation while 0.3% ammonium carbonate solution (pH=7.5)-acetonitrile (75∶25) with wavelength of 224 nm for trace detection. The minimum detectable amount was 0.02 ng. Conclusion The method established can be applied to determinate aristolochic acid and detect trace amout exactly.
   
　　Key words：aristolochic acid；RP-HPLC procedure；sample preparation；chromatographic condition

　　马兜铃酸是马兜铃科植物中的主要成分,近年来已证实其具有肾脏毒性。鉴于马兜铃科植物种类很多,名称混淆现象也很常见,各地方用药种类十分复杂,所以,有必要建立一个简单有效、便于推广的方法对马兜铃酸进行定量分析,以便真实准确地反映出药材或制剂中马兜铃酸的含量,保证用药安全。目前,高效液相色谱法是在马兜铃酸含量测定中使用最多、发展也较为成熟的一种方法,但测定条件多种多样。为此,本试验从供试品溶液的制备、色谱条件的选择两个方面进行了研究,以期建立并推荐一个能准确反映马兜铃酸含量的高效液相色谱法。

　　1  仪器与试剂

    美国科普公司SSI PC3000高效液相色谱仪,Model 500紫外检测器,HORIBA B-212PH计,Anastar色谱工作站。色谱纯试剂购自天津康科德化学试剂厂,分析纯试剂购自山东禹王化学试剂厂。关木通(两年生)采自沈阳药科大学药用植物园,马兜铃酸A对照品购自中国生物制品检定所(批号110746-200204)。

　　2  供试品溶液的制备

　　2.1  提取溶剂的选择

    现有的研究中,马兜铃酸的提取溶剂多数选择甲醇、乙醇、丙酮或加入一定量的酸来提取,有文献报道,丙酮-10%甲酸提取效率较高。我们也重点考察了该浓度酸及常用溶剂对提取效率的影响。取干燥关木通药材粉末(40目),精密称定30份,各0.5 g,分别加入表1所示溶剂各20 mL,每种溶剂各提取2份,共30份,分别浸泡2 h,超声15 min,过滤,滤液蒸干,残渣以甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶中,微孔滤膜过滤后,供HPLC测定用。结果见表1。表1  不同提取溶剂的比较（略）

　　从实验数据看,甲醇、乙醇不适宜对马兜铃酸进行提取,加入酸或醇水溶液,可使马兜铃酸的提取效率显著增加,综合比较各种溶剂,70%甲醇对马兜铃酸的提取效率最高,可以作为马兜铃酸的最优提取溶剂。

　　2.2  提取方法的选择

    ①索氏提取法：取0.5 g关木通药材粉末4份,以70%甲醇120 mL分别索氏提取1、2、3.5、5 h,分别测定含量,结果表明3.5 h后峰面积不再增加。②直接加热回流法：取关木通粉末1份,提取溶剂为70%甲醇25 mL,提取1 h,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取2次,分别得滤液并测定含量。结果表明,关木通提取1次即1 h即提取完全。③超声提取法：取关木通粉末1份,提取溶剂为70%甲醇25 mL,提取15 min,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取4次,分别得滤液并测定含量,结果表明,关木通重复提取4次即1 h,即提取完全。见图1。

    从图1可以看出,在提取完全的情况下,超声提取法需提取4次,耗费1 h,消耗溶剂共100 mL；索氏提取法需提取3.5 h,消耗溶剂120 mL；直接加热回流法需提取1次,提取1 h,消耗溶剂25 mL,即可提取完全。故建议选择直接加热回流法提取。