RP-HPLC法测定马兜铃酸含量方法的优化

　　3  色谱条件

　　3.1  流动相对马兜铃酸含量测定的影响

    从大量的文献报道来看,马兜铃酸含量测定的流动相一般使用甲醇-水系统[1]、乙腈-水系统[2],另有采用乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5)[3]系统,本试验对不同流动相系统[甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)、乙腈-水-冰醋酸(50∶50∶1)、乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5,25∶75)]进行了比较,见表2。
   
　　由表2可以看出,3种流动相条件均可与其他成分实现基本分离,理论塔板数也符合定量分析的要求,但在乙腈-水系统下,马兜铃酸计算含量偏低。表2  不同流动相系统的比较（略）

　　3.2  低酸度对色谱分离的影响

    由于马兜铃酸属于酸性物质,流动相中加入适量的酸可以改善峰形,但是酸的加入将会影响色谱住的使用寿命,本节探讨不同酸度对马兜铃酸分离的影响,结果见表3。表3  低酸度对色谱分离的影响（略）

　　从表3可以看出,甲醇-1%醋酸水溶液流动相条件分离度良好,理论塔板数符合定量分析要求,降低酸度不影响色谱分离,甲醇-1%醋酸水溶液适合作为含量测定的流动相条件。

　　3.3  痕量分析时色谱条件的选择

    仪器及方法的检测限度是进行马兜铃酸痕量分析的重要指标,为确保用药的安全性,要求色谱条件具有较低的检测限。马兜铃酸有4处最大吸收,即224、250、319、390 nm。取配置好的0.05 mg/mL马兜铃酸对照品溶液,采用无限稀释法,流动相选择甲醇-1%醋酸水溶液及乙腈-0.3%(NH4)2CO3(PH=7.5),并配以不同检测波长进行最低检出限度的考察,结果见表4。表4  不同色谱条件的最低检测限度(略)

　　从表4可以看出,乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)配以224 nm检测波长可以获得最低的检出限度(见图2),该条件可用于限度检出。

    此外,根据样品在不同波长下的最低检测限可以看出,样品在390 nm处检测限较高,不适合作为马兜铃酸含量测定时的检测波长,而250 nm及319 nm检测波长下检出限较低(<1 ng),信号相对较高,适合作为含量分析的检测波长。同时,考虑到224 nm检测波长在复杂样品分析时易出现杂质峰干扰,不建议作为含测检测波长。

　　4  小结与讨论

    本试验对高效液相色谱方法测定马兜铃酸含量的供试品溶液的制备方法进行了条件优化选择,确定供试品溶液的制备方法为70%甲醇直接加热回流法进行提取。

    在流动相选择上,研究发现,甲醇-1%醋酸水溶液(70∶30) 及乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)可以满足马兜铃酸含量分析需要,结果较为准确。当药材中马兜铃酸含量较低,需进行痕量分析时宜选择流动相为乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5),检测波长为224 nm。

    本试验首次对甲醇-水分离马兜铃酸的酸度进行了考察,发现采用低酸度的甲醇-1%醋酸水溶液对马兜铃酸进行含量测定,不仅可以获得良好的分离效果,且可以减缓流动相对色谱柱的损耗,适宜用作马兜铃酸的含量测定方法。

【参考文献】
  　　[1] 由丽双,王智民,姜 旭,等.HPLC法测定不同产地关木通中马兜铃酸A的含量[J].中国中药杂志,2003,28(5)：465－467.

　　[2] Chang YS, Deng JS, Ku YR. Determination of aristolochic acid in traditional Chinese prescriptions, containing Radix Aristolochiae Fangchi by HPLC[J].J Liquid chromatography & related technologies,2002,25(6)：961－975.

　　[3] Lee T Yei, Wu ML, Deng JF, et al. High-Performance Liquid Chromatographic dertermination for aristolochic acid in some medicinal plants and slimming products[J].J Chromatography B, 2002,766：169－174.