HPLC法测定不同外植体诱导虎杖愈伤组织中大黄素含量

　　2.2.3  供试品溶液的制备[5] 

　　选取由叶片、茎段、叶柄不同外植体诱导的虎杖愈伤组织干燥研细,过60目筛,精密称取约0.1 g,加入三氯甲烷25 mL和2.5 mol/L硫酸溶液20 mL,称定重量,置80 ℃水浴回流2 h,冷却后,称重,用三氯甲烷补足失重,摇匀,水浴蒸干,残渣用1 mL甲醇溶解,用0.45 μm微孔滤膜过滤,备用。

　　2.2.4  线性关系试验

　　取100 μg/mL的对照品溶液用甲醇稀释为5、2.5、1.25、0.5和0.25 μg/mL,进样量为20 μL,以对照品峰面积Y为纵坐标,以进样浓度(μg/mL)Ｘ为横坐标进行线性回归,得回归方程为：Y＝83 587X－0.114 8(r＝0.999 85)。表明大黄素在0.25～5 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

　　2.2.5  精密度试验 

　　精密吸取同一对照品溶液(5 μg/mL)20 μL,重复进样5次,测定大黄素的峰面积值,RSD＝0.71%,表明仪器精密度良好。

　　2.2.6  稳定性试验 

　　将待测样品溶液在室温下贮存,在相同的色谱条件下,每隔2 h进样1次,共5次(n＝5),测定大黄素的峰面积值,RSD＝0.91%,表明该样品溶液在10 h内基本稳定。

　　2.2.7  重复性试验 

　　取同一供试样品5份(n＝5),每份0.1 g,精密称取,按“2.２.3”项中的方法处理,残渣用0.1 mL甲醇溶解,测定大黄素的峰面积值,结果大黄素峰面积值RSD＝1.37%,表明重现性良好。

　　2.2.8  加样回收率试验 

　　采用加样回收法。精密称取已知含量(4.165 μg/mL)的样品,分别精密加入一定量的大黄素(5.000 μg/mL)对照品,按“2.2.1”项的色谱条件依法测定峰面积,计算回收率。结果平均回收率为101.19%,RSD＝1.20%。结果见表1。表1  加样回收率试验测定结果(略)
  
　　2.2.9  含量测定 

　　精密称取干燥愈伤组织粉碎品,按“2.2.3”所述方法制备供试品溶液,吸取20 μL供试品溶液注入高效液相色谱仪,测定含量。结果见表2。表2  样品中大黄素含量测定结果（略）注：大黄素含量均为3次样品测定的平均值

　　3  讨论

  　  由于野生资源的不断匮乏,利用植物组织培养技术来获得次生代谢产物有着广泛的前景。通过本实验所选取的培养条件可成功培养出虎杖的愈伤组织,运用HPLC法检测表明在人工条件下培养的愈伤组织中含有大黄素,其中以茎段诱导愈伤组织中大黄素的含量最高,而由叶片、叶柄来源的愈伤组织中较低,这可能与不同器官次生代谢的能力不同有关[6]。

    　在HPLC法检测过程中,我们选用《中华人民共和国药典》收录的色谱条件对虎杖的3种不同来源的愈伤组织产生大黄素进行提取及含量测定,由图1可知,在该条件下分离的大黄素峰形较好,无拖尾现象,出峰时间为17.56 min。
   
　　本实验的结果为利用组织培养技术筛选大黄素高产植株进行了初步研究,为进一步开展大黄素工业化生产提供理论空间和实验依据。

【参考文献】
  　　[1] 张永乐,付桂芹.药用植物次生代谢工程与中草药的生产[J].中国林副特产,2005,6(12)：69－70.

　　[2] 中华本草编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社,1998.338.

　　[3] 王浴生.中药药理与应用[M].北京：人民卫生出版社,1983.653.

　　[4] 杨培君,李会宁,赵 桦.虎杖的组织培养与快速繁殖[J].西北植物学报, 2003,23(12)：2192－2195.

　　[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社,2005.146.

　　[6] 杨会琴,李 敬,戴翠萍,等.甘草愈伤组织培养及其代谢产物甘草酸的研究[J].河北师范大学学报(自然科学版),2006,30(5)：346－348.