地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探　

              作者：樊慧杰　康慧芳　姚建强　王晓媛　杨利军　牛勃  

【摘要】  ：目的 研究地龙体内两种新型脱氧核糖核酸酶(LDs)的部分生化性质,并对其作用进行初步探索。方法 采用Sephacryl-200柱层析、毛细管等电聚焦电泳法、琼脂糖凝胶电泳等方法。结果 初步得出LD1、LD2分子量为126、62 kDa；确定了等电点分别为6.12、6.05。LD1、LD2对细菌质粒DNA、λDNA均有分解作用。结论 地龙中的LDs是一种新型的脱氧核糖核酸酶。明确LDs的分子量、等电点有助于优化LDs的提取工艺以及LDs的进一步研究。对细菌质粒DNA、λDNA的降解提示LDs有可能对抗细菌的耐药性。

【关键词】  地龙　脱氧核糖核酸酶　分子量　等电点

　　Abstract：Objective To study partial biochemical characterization and effect of lumbricus dornases (LDs). Methods Sephacryl-200 column chromatography, CIEF and agarose electrophoresis were used to determine LDs. Results The molecular weights of LD1 and LD2 were 126 kDa and 62 kDa respectively. The pI of LD1 and LD2 were 6.12 and 6.05. LDs degraded bacterial plasmid and λDNA. Conclusion LDs is a new kind of dornases. The determination of molecular weights and pI of LDs will help their further study. The results of plasmid and λDNA degradation imply that LDs can oppose bacteria drug resistance.

　　Key words：lumbricus；dornases；molecular weight；pI

   　 地龙,又名蚯蚓,属无脊椎动物,环节动物门,寡毛纲。地龙性寒味咸,功能清热平肝、熄风止痉、平喘、利尿、通络除痹。主治高热烦躁、惊厥抽搐、肺热喘咳、热结尿闭以及疮疡脓毒等症。国内外研究已发现,蚯蚓体内有溶栓酶、蚓激酶、胆碱酯酶、过氧化氢酶[1]、溶菌酶[2]、Lysenin[3]等有效成分。作为有4 000余年药用历史的地龙,对其开发利用还是远远不够。本课题组致力于地龙的研究,从地龙中分离纯化出脱氧核糖核酸酶样的物质(LDs)。本实验主要研究LDs分子量、等电点,并对其作用进行初步探索。证实LDs为新型的脱氧核糖核酸酶,具有不同的性质。同时为LDs的研究开发提供可靠的实验依据。

　　1  实验材料

　　1.1  样品与试剂
   
　　分离、纯化的LD1、LD2。蓝色葡聚糖2000(Blue dextran- 2000),Pharmacia；Coomassie Brilliant Blue G250, Fluka；毛细管等电聚焦试剂盒(cIEF3-10 Kit)；质粒(pBV220),由本实验室自备；λDNA,Sigma公司产品。其它所用试剂均为分析纯。

　　1.2  主要仪器
   
　　Gradifrac V1.2层析系统,pharamacia公司；毛细管电泳仪：BECKMAN 55002。

　　2  实验方法

　　2.1  分子量测定
   
　　凝胶过滤层析(分子筛)法：参照文献[4]方法。

　　2.2  等电点测定

 　   毛细管等电聚焦电泳法：参照文献[5]方法。

　　2.3  LDs对质粒的降解作用

　　取3 μL质粒(pBV220),分别加入LD1、LD2 10 μL,37 ℃反应30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。

　　2.4  LDs对λDNA的降解作用
 
　　取2 μLλDNA,分别加入LD1、LD2 10 μL,37 ℃反应30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。

　　3  结果

　　3.1  凝胶过滤层析(分子筛)测定LDs分子量
  
　　以标准蛋白质洗脱体积为纵坐标,标准蛋白质分子量的对数为横坐标,绘制标准曲线。根据LD1、LD2的洗脱体积,查标准曲线,并计算出用Sephacryl S-200测得LD1、LD2分子量分别为126、62 kDa。