地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探　

　　3.2  LDs等电点的测定结果

  　  毛细管等电聚焦法测定等电点的结果：LD1、LD2等电点分别为6.12、6.05。

　　3.3  LDs对质粒(pBV220)的降解作用(见图1)
  
　　LD1、LD2与质粒作用30 min后电泳,EB染色观察,LD1、LD2彻底降解了质粒。倍比稀释的LD1、LD2分解质粒的作用减弱,可以看到仍有微弱的质粒条带出现。LDs对质粒有明显的降解作用,从图1中看不出LD1、LD2对质粒的降解作用有明显的差别。
  
　　3.4  LDs对λDNA的降解作用(见图2)
   
　　LDs与λDNA作用30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。LD1、LD2 作用后的λDNA条带减弱,图2的下方有云雾状的阴影,为λDNA的降解产物。说明LD1、LD2有降解λDNA的作用。图2中看不出LD1、LD2对λDNA降解作用有明显的差别。

　　4  讨论
   
　　脱氧核糖核酸酶(DNase)已在不同的物种中发现,目前针对其研究较多的是DNaseⅠ、DNaseⅡ。DNaseⅠ是Sachs[6]1905年首次在牛胰腺中发现,现对DNaseⅠ的研究已扩展到人、鸡、鼠、犬及鲤鱼等动物。已纯化出不同来源的DNaseⅠ的分子量在32～41 kDa范围之间,等电点在3.9～4.7之间。DNaseⅡ存在于各种哺乳动物的组织中[7],尽管来自各种不同种属和组织的DNaseⅡ的化学性质并不完全一样(如分子量、亚基结构),但这些酶的酶学性质非常相似。迄今已纯化出不同来源的DNaseⅡ的分子量范围在26.5～45 kDa之间。我们发现的LD1、LD2分子量为126、62 kDa；等电点为6.12、6.05。LDs与DNaseⅠ、DNaseⅡ分子量有很大差别,分子量远远大于DNaseⅠ、DNaseⅡ；LDs的等电点也明显不同于DNaseⅠ。可以推测,LDs是新型的脱氧核糖核酸酶,具有不同的性质。
   
　　质粒是细菌染色体以外能自主复制的,双链共价闭合环状DNA。细菌对药物产生抗性,原因多种。现在研究的热点是耐药性质粒(其携带耐药基因),质粒可以从一个细菌进入另一个细菌,耐药基因也从一个细菌传到另一个细菌,致细菌耐药性的广泛产生。噬菌体是感染细菌的一类病毒,有的噬菌体基因组较大,如λ噬菌体和T噬菌体。λ噬菌体由外壳蛋白和λDNA(线状双链DNA分子)组成。通过溶原性方式λDNA能整合到细菌染色体DNA中,与λDNA相毗邻的细菌基因有可能被噬菌体从一个细胞转移到另一个细胞(即转导),使遗传性状在不同细菌个体间传播。本实验表明,LDs能降解耐药质粒和λDNA,推测LDs有可能阻断细菌遗传形状的改变(如细菌的耐药性)。LDs彻底降解了质粒,同样条件下对λDNA是部分分解。λDNA为48 502 bp,远远大于质粒(pBV220：3 665 bp),LDs降解λDNA较质粒会困难些。

 　   在临床上重组人DNase(rhDNase)已用于治疗支气管扩张、肺脓疡等。现认为重组人DNase可以分解黏液中的DNA,减轻炎症从而发挥作用[8]。提示作为一种新脱氧核糖核酸酶的LDs同样有可能对抗炎症,起到治疗作用。

 　   LDs是新蛋白质,是蚯蚓开发的新思路。本实验研究了LDs的部分性质,为LDs的深入实验及开发利用做了铺垫。LDs的研究可以为地龙治疗肺热喘咳、热结尿闭以及疮疡脓毒等症提供理论依据。

【参考文献】
  　　[1] 单鸿仁,张祖珣.蚯蚓在医学中的应用研究[M].太原：山西科学教育出版社,1991.30－37.

　　[2] Ito Y, Yoshikawa A, Hotani T. Amino acid sequences of lysozymes newly purified from invertebrates imply wide distribution of a novel class in the lysozyme family[J]. Eur J Biochem,1999,259(1-2)：456－461.

　　[3] Kobayashi H, Ohta N, Umeda M. Biology of lysenin, a protein in the coelomic fluid of the earthworm eisenia foetida[J]. International Review of Cytology,2004,236：45－99.

　　[4] 李建武,萧能赓,余瑞元,等.生物化学实验原理和方法[M].北京：北京大学出版社,1994.209－211.

　　[5] 郭尧君.蛋白质电泳技术[M].第2版.北京：科学出版社,1999.125－132.

　　[6] Napirei M, Ricken A, Eulitz D, et al. Expression pattern of the deoxyribonuclease 1 gene：lessons from the DNase1 knockout mouse[J]. Biochem J,2004,380(Pt 3)：929－937.

　　[7] Yasuda T, Nadano D, Awazu S, et al. Human urine deoxyribonuclease Ⅱ(DNase Ⅱ) isoenzymes：a novel immunoaffinity purification, biochemical multiplicity, genetic heterogeneity and broad distribution among tissues and body fluids[J]. Biochim Biophys Acta,1992,1119(2)：185－193.

　　[8] Shak S, Capon DJ, Hellmiss R, et al. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(23)：9188－9192.