甘肃不同产地当归ITS序列分析

　　1.4  序列测定和分析
   
　　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生物工程技术服务有限公司测序,每个样品均采用双向测序。测序结果以已经发表于genebank中的当归ITS序列确定ITS序列的边界,并进行两端碱基手工修订。各序列特征采用DNAStar软件进行统计分析；DNA序列的用DNAMAN软件排序,排序后的序列采用MEGA4[1](molecular evolutionary genetics analysis 4)分子进化遗传分析软件,根据Kimura-2参数遗传距离(kimura-2 parameter genetic distance)法计算各样品间的遗传距离值。

　　2  结果与分析

　　2.1  ITS长度与GC质量分数比较
   
　　本实验测得的9样品ITS(包括5.8s)序列中7样品为600 bp, 2样品为601 bp。所有样品5.8srDNA高度一致,无碱基差异。ITS一区有3个变异位点,ITS二区有3个变异位点。各样品ITS序列(包括5.8s)G＋C含量范围在54.1%～54.6%之间。

　　2.2  基于ITS分析各样品间的遗传距离

　　(见表2)表2  各样品间的遗传距离（略）

　　3  讨论
   
　　道地药材的形成是特定的基因型,在特定的生境下受到复杂的调控,导致次生代谢过程的关键酶基因的表达产生了时空差异的结果,其形态及次生代谢产物的多样性是由基因的遗传变异引起的[2]。不少学者在研究道地药材分子机理时,都期望能找到决定道地药材的表型的关键酶基因,发现道地药材特定的基因型,但尚未取得突破性进展。ITS序列作为种以下一级分类群亲缘关系研究的重要基因序列,在中药材道地性研究中也得到了广泛应用。研究发现,海拔高的岷县、宕昌所产当归阿魏酸、挥发油含量显著高于漳县、渭源、定西、陇西当归,岷县当归的阿魏酸、挥发油、水溶性多糖及浸出物含量显著高于漳县产当归[3]。我们采集的9号样品来自漳县贵清山,其产地虽属漳县但因来自山体,其海拔比漳县其他3样品高,与岷县海拔及生长环境接近。我们在对岷、漳两县当归ITS序列研究时发现各样品间的遗传距离极小,在0.000 0～0.008 3之间,9个样品间的碱基变异位点只有6个,岷县5个样品与漳县9号样品在586位都为C,589位都为T,而漳县其他3个样品在这2个位点分别为T和G,这一结果与两地当归成分研究出现了统一性,因此,我们认为这2个位点碱基可能成为“岷当归”的碱基鉴别位点,不过其可靠性还需进一步研究证实。

【参考文献】
  　　[1] Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S. MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution,2007,24：1596－1599.

　　[2] 黄璐琦.分子生药学[M].北京：北京大学医学出版社,2006.115－116.

　　[3] 欧阳晓玫,何英梅,朱俊儒,等.不同商品规格的甘肃当归的综合质量评价[J].中医药学报,2005,33(4)：12－14