高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素的含量

　　2.4  工作曲线

    称取甘草苷对照品6.28 mg、甘草酸对照品5.99 mg,分别用甲醇定容于25 mL容量瓶中,作为甘草苷和甘草酸对照品储备液。另取异甘草素对照品4.35 mg,置25 mL容量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度,再精密吸取0.4 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得异甘草素储备液。分别精密吸取甘草苷储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,甘草酸储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,异甘草素储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,置6个10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为系列混合标准溶液。分别进样20 μL,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积。以峰面积对进样量(μg)进行回归,得回归方程。甘草酸：Y＝1×106X＋16 220,r2＝1；甘草苷：Y＝2×106X＋49 444,r2＝0.999 5；异甘草素：Y＝1×107X＋4.466 7,r2＝1。色谱图见图1。甘草苷、甘草酸、异甘草素色谱峰理论塔板数分别为4万、14万和21万。

　　2.5  精密度试验

    取上述混合标准溶液,连续进样6次,结果甘草酸、甘草苷、异甘草素的峰面积RSD分别为0.65%、0.35%、0.40%,表明精密度符合要求。

　　2.6  稳定性试验

    取甘肃总寨甘草样品1份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,室温放置并于0、2、4、6、8、10 h进样,记录色谱图,代表性色谱图如图2。故以甘草酸、甘草苷和异甘草素三者的峰面积计算10 h的稳定性。结果甘草酸、甘草苷、异甘草素峰面积RSD分别为0.29%、0.49%、0.85%,表明甘草供试品在10 h内稳定。

　　2.7  重复性试验

    取甘肃总寨甘草样品6份,每份0.1 g,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定,结果甘草酸、甘草苷和异甘草素的峰面积RSD分别为2.15%、2.10%、2.63%,表明本法重复性好。

　　2.8  加样回收率试验
   
　　称取甘草苷对照品适量,加甲醇制备成每1 mL含0.663 mg的对照品溶液；称取甘草酸对照品适量,加甲醇制备成每1 mL含0.611 5 mg的对照品溶液；取甘肃总寨甘草样品6份,每份0.05 g,精密称定,分别置6个25 mL容量瓶内,分别加入上述甘草苷对照品溶液2 mL、甘草酸对照品溶液4 mL、“2.3”项中的异甘草素储备液1 mL,再分别按照“2.3”项下方法制备得供试品溶液,依法试验,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积,并计算加样回收率,结果加样回收率符合规定。结果见表2。表2  甘草酸、甘草苷、异甘草素的加样回收率试验结果(略)

　　2.9  样品测定

    按上述色谱条件,依法测定了内蒙古杭锦旗1～5年生栽培甘草样本中甘草酸、甘草苷和异甘草素的含量,结果见表3。表3  杭锦旗栽培甘草不同年限3种成分的含量测定结果(略)

　　3  讨论

    由以上试验结果可知,本法线性良好,精密度、稳定性好,重复性和加样回收符合规定,可以作为甘草中甘草苷、甘草酸和异甘草素同时测定的方法。
   
　　前期在提取溶剂的选择过程中考察过80%氨性甲醇、80%氨性甲醇提取并酸化后定容、80%甲醇(大部分测定甘草黄酮文献采用的提取溶剂)、67%甲醇[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)测定甘草酸的基本提取溶剂]、甲醇-0.2 mo1/L醋酸铵-冰醋酸(67∶33∶1)[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)测定甘草酸的提取溶剂]、70%乙醇[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)测定甘草苷的提取溶剂]、50%乙醇(日本、美国药典测定甘草酸的提取溶剂)。结果表明,除2种氨性甲醇系统外,5种溶剂对各共有成分提取效果近似,综合考虑甘草苷、甘草酸和几个主要共有成分,67%甲醇综合提取效果相对略好,且对甘草苷、甘草酸提取效果分别好于药典相应提取条件[2]。

    以本法测定内蒙古杭锦旗甘草样品显示,不同年限甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素存在着一定的差异。

【参考文献】
  　[1] 段天璇,于密密,刘春生,等.HPLC法同时测定甘草指纹图谱暨甘草苷、甘草酸含量[J].中成药,2006,28(2)：161－165.

　　[2] 闫永红.不同来源甘草的质量特征及评价研究[D].北京中医药大学博士研究生学位论文.北京.2006.22－47.