桂枝甘草汤方药半仿生提取法药材组合方式的优选
2.6 肉桂酸含量测定
2.6.1 色谱条件
检测波长267 nm；柱温：35 ℃；灵敏度：1.0 AFUS；流动相：甲醇-0.1%磷酸(52∶48)；流速：1.00 mL/min；进样量：20 μL。在上述色谱条件下,肉桂酸与甘草次酸均可达到基线分离,分离度大于1.5,理论塔板数2 778。
2.6.2 线性关系考察
精取肉桂酸对照液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL,分别加甲醇定容至1 mL,各取20 μL进样,测定峰面积。以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,结果肉桂酸在0.11～0.44 μg范围内,其质量(μg)与峰面积呈良好的线性关系,回归方程：Y＝7.467 7×106X＋123 315.29,r＝0.999 8。
2.6.3 样品含量测定
取供试液B,用0.45 μm微孔滤膜滤过, 进样20 μL,按“2.6.1”项下色谱条件测定,结果见表2,色谱图见图2。表2 2种组合提取液中肉桂酸的含量测定结果(略)注：与单煎混合液比较,☆☆P＜0.01
2.7 总黄酮含量测定
2.7.1 线性关系考察
精取柚皮苷对照液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL,加入甲醇1 mL,再加入10%KOH溶液0.5 mL,室温放置5 min,用甲醇稀释并定容至10 mL,以甲醇作空白对照,在412 nm处测定吸收度。以浓度C(μg/mL)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,结果总黄酮的线性范围为20～100 μg/mL,回归方程：A＝0.052 17C－0.019 7,r＝0.996 4。
2.7.2 样品含量测定
精取供试液C各4 mL,用甲醇稀释并定容至100 mL。取上述稀释液1 mL,加10%KOH溶液0.5 mL,室温放置5 min,用甲醇稀释至10 mL,在412 nm处测定吸收度。另取上述稀释液1 mL,用甲醇稀释至10 mL,作为空白对照。总黄酮的含量以柚皮苷计算,结果见表3。表3 2种组合提取液中总黄酮的含量测定结果(略)注：与单煎混合液比较,☆☆P＜0.01
2.8 干浸膏得量测定
精取“2.2”项下提取液各10 mL,分别置恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,烘至恒重,计算干浸膏得量,结果见表4。表4 2种组合提取液中干浸膏得量测定结果(略)
2.9 挥发油的含量测定
按2005年版《中华人民共和国药典》(二部)附录XD挥发油测定法(甲法)[3]测定,结果见表5。表5 2种组合提取液中挥发油的含量测定结果(略)注：与单煎混合液比较,☆P＜0.05
2.10 HPLC指纹图谱比较
2.10.1 色谱条件
检测波长254 nm；柱温：35 ℃；灵敏度：1.0 AFUS；流动相：甲醇-0.1%磷酸；甲醇(5%)4 min,甲醇(28%)→甲醇(52%)11 min,甲醇(52%)→甲醇(84%)10 min,甲醇(84%)→甲醇(100%)10 min；流速：1.00 mL/min；进样量：20 μL。
2.10.2 HPLC图谱的测定比较
取供试液D分别进样,进行色谱分析。结果总峰面积：单煎混合液为9 215 519,混煎液为13 299 913。以保留时间15.190 min色谱峰的保留时间为1.0,计算2种组合提取液的主要特征峰的相对保留时间,结果2种组合提取液中主要特征峰的相对保留时间基本一致。主要特征峰的峰面积见表6,色谱图见图3、图4。表6 HPLC图谱中主要特征峰的峰面积（略）
HPLC指纹图谱显示,在此分析范围内,2种组合提取液的色谱峰数及峰位基本一致,说明二者的成分基本一致。主要特征峰的总峰面积：混煎液＞单煎混合液,尤以3、10号峰峰面积相差较大。主要特征峰占总峰面积比例,单煎混合液为52.68%,混煎液为58.63%,二者差别不大。
3 小结与讨论
我们将桂枝甘草汤方药组合成2组,用均匀设计优选出的SBE法工艺条件进行提取,提取液作甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、挥发油、干浸膏的含量测定及50%乙醇精制液HPLC指纹图谱比较。结果除干浸膏含量单煎混合液与混煎液相近外,其余4个指标成分的含量,混煎液均明显高于单煎混合液。其中甘草次酸、肉桂酸的含量,混煎液分别是单煎混合液的2.53和1.88倍。2种组合提取液HPLC指纹图谱无明显差异。HPLC梯度洗脱总峰面积及主要特征峰峰面积：混煎液＞单煎混合液。综合以上实验结果,认为桂枝甘草汤方药成分提取时以桂枝、甘草混合提取为佳。本结果表明,2种组合水提取液中甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、挥发油含量,混煎液明显高于单煎混合液,说明桂枝与甘草配伍后利于其有效成分的溶出,同时也说明古方将二者配伍入汤剂是有其科学道理的。
【参考文献】
[1] 沈建伟,王明艳,赵凤鸣,等.两种中药复方拮抗环磷酰胺致突变作用的研究[J].癌变·畸变·突变,1999,11(1)：38.
[2] 王明艳,吴海涛,赵鸣芳,等.4种方药对环磷酰胺诱发的SCE的抑制作用[J].中成药,2000,22(3)：212.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京：化学工业出版社,2005.附录XD.