红芪总黄酮对人白血病细胞诱导分化的影响

【摘要】  目的 研究红芪总黄酮对人早幼粒白血病HL-60细胞诱导分化的作用及其分子机制。方法 HL-60细胞经红芪总黄酮处理后,检测细胞NBT还原能力的改变,用流式细胞仪测定细胞增殖周期及CD11b、C-fos表达。结果 红芪总黄酮作用于HL-60细胞后,NBT还原能力增强；CD11b表达升高；细胞被阻滞于G0/G1及G2/M期,S期细胞数相应减少；C-fos基因表达增强。结论 红芪总黄酮可诱导HL-60细胞分化成熟,其机制可能与上调C-fos基因表达有关。

【关键词】  红芪；黄酮化合物；HL-60细胞；C-fos基因

   红芪为豆科植物多序岩黄芪(Hedysarum polybotrys Hand.- Mazz)的干燥根,是黄芪中的上品,具有补气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等多种功效。黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分,广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中,是目前人们比较关注的一类化合物。该类成分对白血病细胞生长、分化、凋亡等方面的影响及其机制的研究也已成为目前的热点之一。本实验对红芪总黄酮诱导白血病细胞分化的作用进行了研究并初步探讨其作用机制,为红芪总黄酮的开发利用提供实验依据。

　　1  实验材料
   
　　红芪为甘肃陇西产道地药材,经我院中药鉴定教研室张西玲教授鉴定为正品,其总黄酮由本研究室分离和纯化,含量经测定为88.3%。RPMI1640为美国Sigma公司产品。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。CD11b-FITC荧光标记单克隆抗体；兔抗人C-fos多抗、羊抗兔FITC-IgG二抗购自美国Santa Cruz公司。其他均为市售分析纯试剂。

　　2  实验方法

　　2.1  细胞培养 

　　HL-60细胞由本院科研中心细胞生物研究室传代保存。常规培养,培养液为含10%的小牛血清,青、链霉素各100 U/mL的RPMI1640,在37 ℃、饱和湿度、5% CO2孵箱中培养,每2～3 d换液传代培养,选取对数生长期细胞用于实验。

　　2.2  细胞功能学分化检测
 
　　采用NBT还原实验,药物处理48 h后,细胞悬液中加入等量NBT反应液(0.2%NBT,TPA 600 μg/L), 37 ℃保温1 h,离心弃上清,制细胞涂片,计数至少200个细胞,计算NBT阳性细胞百分率。

　　2.3  细胞表面标记检测

　　参照文献[1]方法,取药物处理48 h的HL-60细胞,PBS洗2次,调节细胞浓度为每升1.0×109 个,取100 μL,加入CD11b-FITC单抗10 μL,混匀后避光孵育30 min,再用含0.5%小牛血清的PBS洗2次,于流式细胞仪(美国Becman-Coulter公司)上分析FITC(对数值)对细胞数的直方图,并得出阳性表达率。

　　2.4  细胞周期分析

　　收集4 mg/L红芪总黄酮处理48 h的细胞,调节细胞浓度为1.0×109/L,流式细胞仪检测,采用美国Verity Software House公司设计的ModFit LT分析软件分析细胞周期。

　　2.5  分化相关基因检测[2]

    收集经不同浓度药物处理48 h的HL-60细胞2.5×106个,用PBS洗两次后,加预冷(4 ℃)70%乙醇1 mL固定,-20 ℃保持12 h以上。用前离心去除固定液,PBS洗两次,调节细胞浓度为1.5×109个/L。各取此细胞悬液200 μL,1∶200稀释的兔抗人C-fos多抗200 μL,37 ℃孵育30 min,PBS洗2次,弃上清液,再加入1∶100稀释的羊抗兔FITC-IgG二抗150 μL,37 ℃避光孵育30 min,PBS洗2次,流式细胞仪上分析FITC(对数值)对细胞数的直方图,并得出阳性表达率。

　　2.6  统计学方法
 
　　以上每组实验及检测均重复3次以上,实验结果用x±s表示,用SPSS11.0软件进行t检验分析。

　　3  结果

　　3.1  细胞功能检测

    NBT还原测定表明,HL-60细胞经60、80、100 mg/L红芪总黄酮处理48 h后,NBT阳性率分别为(31.2±2.6)%、(48.7±3.7)%、(61.8±5.6)%,较未加药组(13.1±1.1)%明显升高(P<0.01)。