HPLC法测定藤黄中藤黄酸和新藤黄酸的含量

　　2.3  对照品溶液的制备

    精密称取藤黄酸对照品9.8 mg和新藤黄酸对照品各10.2 mg,置于10 mL容量瓶中,加甲醇定容,精密移取0.5 mL至10 mL容量瓶中,制成每1 mL分别含0.049 mg和0.051 mg的混合溶液,作为对照品溶液。

　　2.4  线性关系考察

    精密量取“2.3”项下对照品溶液0.5、1、2、4 mL置10 mL容量瓶中,加甲醇定容,分别吸取25 μL注入液相色谱仪,在360 nm波长下测定。以峰面积积分值为纵坐标、对照品浓度(μg)为横坐标作图及回归处理,得藤黄酸和新藤黄酸回归方程,分别为：Y＝11 334.8＋232 781X,r＝0.999 9(n＝5)；Y＝75 197.5＋226 301X(r＝0.999 7,n＝5)。结果表明：藤黄酸在2.45～49 μg、新藤黄酸在2.55～51 μg范围内呈良好线性关系。

　　2.5  精密度考察

    分别吸取“2.4”项下4 mL溶液配置成的对照液25 μL,连续进样5次,测定峰面积,外标法计算含量,计算RSD值。结果表明：藤黄酸和新藤黄酸含量的RSD分别为0.18%和0.24%,本试验进样精密度良好。

　　2.6  重复性试验

    取同一批次样品,按供试品溶液制备方法处理样品6份,测得藤黄酸和新藤黄酸的平均含量,分别为30.87%和11.66%；RSD分别为1.1%和2.3%。

　　2.7  稳定性试验

    室温下,精密吸取已知浓度的藤黄粗提物溶液25 μL,于0、0.5、1、2、3、4、5 h进样测定,结果藤黄酸和新藤黄酸峰面积的RSD分别为0.66%和0.94%,表明供试品溶液在5 h内稳定。

　　2.8  加样回收率试验

    取已知含量的藤黄药材(藤黄酸30.21%、新藤黄酸11.59%)粉末约0.2 g,6份,精密加入藤黄酸及新藤黄酸含量80%、100%、120%的藤黄酸和新藤黄酸,按照“2.2”项下供试品溶液制备方法制备,回收率测定用加样样品并依法测定。结果见表1。表1  加样回收率试验结果(略)

　　2.9  含量测定

    精密称取同一批藤黄药材0.2 g,6份,按照“2.2”项下条件制成供试品溶液,按上述色谱条件测定。结果见表2。表2  藤黄药材中藤黄酸和新藤黄酸的含量测定结果(略)

　　3  讨论

　　3.1  测定波长的选择

    取“2.3”项下对照品溶液25 μL注入色谱仪,于190～400 nm扫描,结果藤黄酸最大吸收波长为217、290、363 nm,新藤黄酸最大吸收波长为214、358 nm,综合考虑选择360 nm为检测波长,藤黄酸和新藤黄酸都有良好响应。

　　3.2  流动相的选择

    曾选用甲醇-水作为流动相,但藤黄酸和新藤黄酸出现拖尾峰,故在水的流动相中加入0.1%冰醋酸,结果藤黄酸和新藤黄酸对称度良好。

　　3.3  提取方法的选择
   
　　除超声方法提取外还考察了另一种提取方法：精密称取细粉0.2 g,加甲醇50 mL,回流0.5 h, 精密吸取1 mL至10 mL容量瓶,定容至刻度,经0.45 μm微孔滤膜过滤,进样,结果藤黄酸与新藤黄酸含量分别为30.89%(RSD＝2.8%,n＝3)和11.03% (RSD＝3.4%,n＝3),含量与超声方法提取并无显著性差异,但超声方法提取简便、省时。超声时间确定中,取同一批制剂分别超声10、20、30 min及1 h,结果超声20、30 min与1 h测定结果并无显著性差别。

【参考文献】
  1] 杨 虹,丛晓东,蒋王林,等.高效液相色谱-蒸发光散射检测法对藤黄中藤黄酸及其衍生物的含量测定[J].中国药科大学学报,1999,30(3)：202－205.

　　[2] 叶定江,吴 皓,胡 勇,等.藤黄及其炮制品中藤黄酸含量的比较[J].中国中药杂志,1995,20(10)：601－602.