HPLC法测定抗瘤丸中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1的含量
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 μL,连续进样5次,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.38%、0.22%、0.38%,结果表明精密度良好。
2.7 稳定性试验
精密吸取对照品溶液10 μL,分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.34%、0.20%、0.34%(n=6)。结果表明对照品在制备后12 h内稳定。
2.8 重复性试验
精密称取同一样品(批号20061031)的样品5份,依“2.3”项下方法制备供试品溶液并按“2.1”项下色谱条件测定。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.33%、2.28%、2.76%。
2.9 阴性对照试验
精密吸取阴性对照液,按“2.1”项下色谱条件测定,在三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1处无吸收蜂,表明抗瘤丸中的其它成分对三七成分的测定不干扰。
2.10 加样回收率试验
精密称取同一批已知含量的本品研匀,精密加入一定量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1,依“2.3”项下方法制备,并按“2.1”项下色谱条件测定,计算回收率,结果见表1~表3。表1 三七皂苷R1回收率试验结果(略)表2 人参皂苷Rg1回收率试验结果(略)表3 人参皂苷Rb1回收率试验结果(略)
2.11 样品含量测定
取不同批号的供试品,依“2.3”项下方法制备,并按“2.1”项下色谱条件测定,结果见表4。表4 样品含量测定结果(略)
3 讨论
3.1 提取方法的选择
本品组方较大,提取方法的选择非常重要。通过查阅文献,提取三七皂苷的基本方法有乙醚除脂、甲醇提取、水饱和的正丁醇和氨试液萃取[1],此方法提取繁琐,所用试剂较多,耗时。有大孔树脂的方法[2],但对被测成分有损失,且耗时,不适合此实验。通过几种方法的比较最后确定:乙醚回流2 h,甲醇超声提取。此方法简便快捷,提取有效率高,节省时间,节约试剂。
3.2 流动相的选择
关于HPLC测定三七中皂苷类成分的含量方法,文献报道较多。《中华人民共和国药典》中人参皂苷Rg1等含量测定采用乙腈-0.05%磷酸溶液(99∶400)[3],文献[4]采用甲醇-水(72∶28)为流动相系统,结果三七皂苷均不能达到基线分离。在实验的研究过程中通过采用不同比例的乙腈-0.05%磷酸溶液[5-6]、乙腈-水[7]或甲醇-水[8]梯度洗脱,用乙腈-水[8-9]或乙腈- 0.05%磷酸溶液梯度洗脱[10]等,结果表明,以乙腈-0.05%磷酸溶液0 min(20∶80)-20 min(40∶60)-30 min(20∶80)为流动相,三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1峰的相对保留时间适中,分离效果较好。
本试验建立了HPLC法测定抗瘤丸中三七总皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量的方法[11],简便、准确、重现性好,为制定该制剂质量标准提供了依据。
【参考文献】
[1] 李剑锋,晏亦林.反相高效液相色谱法测定健脾固表颗粒中人参皂苷Rg1、Re的含量[J].医药导报,2006,25(6):573-574.
[2] 朱坤福.HPLC测定冠心片中人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量[J].海峡药学,2006,18(4):90-91.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2000.6,10.
[4] 谢 颖,杨洪芸,张 榕,等.RP-HPLC测定脑得生胶囊中人参皂苷Rg1的含量[J].华西药学杂志,2002,17(3):215-216.
[5] 潘桂香,高秀梅,张伯礼.HPLC测定复方丹参方中三七皂苷类成分的含量[J].中药新药与临床药理,2003,14(4):112.
[6] 王超凡,吴新辉.HPLC测定三七片中人参皂苷Rg1的含量[J].中南药学, 2004,2(3):159.
[7] 毛春芹,陆兔林,叶定江.HPLC法测定三七不同饮片中人参皂苷Rg1的含量[J].中成药,2002,24(12):942.
[8] 刘华钢,赖茂祥,梁秋云,等.三七含量测定方法研究[J].中国实验方剂学杂志,2004,10(5):14.
[9] 王 梅,范亚刚,高文分.RP-HPLC梯度洗脱法同时测定三七总皂苷及血塞通注射液中3种皂苷的含量[J].药物分析杂志,2000,20(6):410.
[10] 沈国芳,伍永江,程翼宇.RP-HPLC法测定血栓通注射液中4种皂苷的含量[J].中国中药杂志,2003,28(9):698.
[11] 何元凯.双波长薄层扫描测定血塞通片中人参皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1的含量[J].中国民族民间医药杂志,2003(5):292-294.