僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究

　　2.2.3  样品E的凝胶色谱分析及其分子量分析 

　　取样品E中TT≥600 s的馏分2 mL上Sephadex G-15(φ1.6 cm×50 cm)柱,用水洗脱盐,4.0 mL/(10 min·管),自动分步收集器收集,测定各管的TT值、260 nm和280 nm处的吸光度及化学反应特性,结果见表1。表1  TT≥600 s馏分的凝胶柱脱盐中馏分的抗凝活性和理化特性检
测结果（略）注：*必要时,通过稀释馏分,测定吸光度在0.2～0.8之间,计算而得

　　2.3  定量分析

　　2.3.1  固形物含量测定 

　　精密吸取样品B～E各2.0 mL,80 ℃下烘至近干,100 ℃下烘至恒重,精密称定,按每1 mL样品溶液扣除5.0 mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和浓度(各样品均为n＝3,RSD不超过0.8%),结果见表2。表2  僵蚕各部位中的固形物和蛋白质测定结果（略）注：*与样品A比

　　2.3.2  指标检测 

　　蛋白质：按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作,计算总氮含量。将该氮含量扣除铵态氮含量,再与6.25相乘,即为蛋白质质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n＝3,RSD不超过1.4%。铵根[9]：按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作(40% NaOH试液用120 g/L氧化镁悬浊液代替),计算铵根质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n＝3,RSD不超过1.2%。草酸根[3]：精密取B～E样品液约5 mL,氯化钙沉淀-高锰酸钾滴定法测定(各样品均为n＝3,RSD不超过1.0%)。结果见表3、表4。表3  僵蚕各部位中铵根和草酸根的测定结果（略）注：*与样品B比表4  僵蚕各部位固形物中蛋白质和草酸铵含量比较（略）

　　2.3.3  HPLC法测定氨基酸含量

　　2.3.3.1  色谱条件 

　　色谱柱：Agilent ODS(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流动相A为50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(82∶17∶1),流动相B为50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(22∶77∶1),梯度洗脱；柱温：27 ℃；流速：1.0 mL/min；荧光检测器：λex 338 nm,λem 425 nm。
2.3.3.2  样品测定  样品溶液B～E经5.7 mol/L盐酸液,在110 ℃水解24 h,OPA试剂衍生化,然后取20 μL注入液相色谱仪。测定结果见表5。表5  僵蚕各部位中氨基酸的测定结果(略)

　　3  讨论
   
　　本研究表明,僵蚕的水煎煮提取、醇沉和凝胶色谱分离所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸类和草酸铵都是其中的主要成分。已有报道,草酸铵具有抗凝活性[8],本研究表明,凝胶色谱分离部位中不含草酸铵,但含多肽和氨基酸类成分的馏分具有抗凝活性,因此,僵蚕中的多肽类或氨基酸类成分可能是抗凝活性成分之一。本研究对僵蚕抗凝活性部位的化学成分和理化特性进行的初步探索,也为今后对僵蚕抗凝成分的分离纯化提供了实验基础。

【参考文献】
  　　[1] 张贵君.现代中药材商品通鉴[M].北京：中国中医药出版社,2001. 2447－2449.

　　[2] 卫功庆,鞠贵春,李慧萍,等.白僵蚕化学成分的分析[J].吉林农业大学学报,1995,17(3)：46－49.

　　[3] 彭新君,彭延古,曾序求,等.僵蚕提取液中蛋白质和草酸铵等成分的定量分析[J].中国中医药信息杂志,2005,12(9)：38－40.

　　[4] 赵建国,彭延古,彭新君,等.薄层色谱法分离僵蚕中蛋白质和氨基酸类成分的研究[J].湖南中医学院学报,2005,25(2)：26－27.

　　[5] 彭延古,葛金文,邓奕辉,等.僵蚕抗凝活性成分的研究[J].湖南中医学院学报,2000,20(4)：18－19.

　　[6] 彭延古,曾序求,徐爱良,等.僵蚕抗内毒素所致细胞膜损伤作用研究[J].湖南中医学院学报,2004,24(3)：1－2.

　　[7] 彭延古,李露丹,邓奕辉.僵蚕抗实验性静脉血栓及作用机理的研究[J].血栓与止血,2001,20(4)：104－105.

　　[8] 赵建国,彭新君,彭延古,等.草酸铵对僵蚕抗凝作用的影响[J].时珍国医国药,2005,16(6)：468－469.

　　[9] 鲍士旦.土壤农化分析[M].第3版.北京：中国农业出版社,2002.54.