响应面分析法优化小鱼仙草总黄酮的提取工艺研究
作者：严云良 吕佩惠 余陈欢
【摘要】 目的： 确定小鱼仙草总黄酮的最佳提取工艺条件。方法： 以乙醇回流提取法提取小鱼仙草总黄酮，采用分光光度法测定总黄酮的含量，以总黄酮提取得率为考察指标，考察溶媒倍数、提取时间和提取次数等因素对小鱼仙草总黄酮提取得率的影响，利用响应面分析法优化提取工艺，确定总黄酮的最佳提取工艺。结果： 小鱼仙草总黄酮的最佳提取工艺为：加药材20倍量浓度为 70%乙醇，于 90℃水浴回流提取 3次，每次 1.9 h。此工艺下小鱼仙草总黄酮的提取得率达8.50%。结论： 该工艺提取得率高、操作简便，易于工业化大生产。
【关键词】 小鱼仙草; 黄酮; 响应面分析法
小鱼仙草为唇形科石荠苧属一年生草本植物Mosla dianthera的全草，别名疏花荠苧、野香薷等。具有祛风发表、利湿止痒之功效，主治感冒发热、扁桃体炎、中暑头痛、溃疡病等[1]。有关小鱼仙草挥发油的研究报道较多，其挥发油主要含有香荆芥酚、百里香酚、芳香醇和丁香烯等成分，具有较好的抑菌作用[2];而对小鱼仙草非挥发性部位的研究报道较少。现代研究表明，其非挥发性部位主要含有黄酮、酚酸等成分，具有抗菌、抗氧化、抗变态反应等作用[3，4]。目前关于小鱼仙草总黄酮提取工艺优化方面的研究少见报道。仅刘小芬等[5]对小鱼仙草总黄酮的提取工艺作了单因素考察，缺乏多因素间的交互作用分析，具有一定的局限性。而响应面分析法(Response surface analysis methodology，RSM)是目前比较通用的设计分析方法，它通过多元二次回归方程拟合多因子实验中多个因子与响应值间的关系，通过对方程求极值的方法达到参数优化的目的[6～9]。本研究在前期单因素实验的基础上，采用响应面分析法，根据BoxBehnken组合设计原理，考察了影响小鱼仙草总黄酮回流提取效果的主要因素，确定了其最佳提取工艺条件，为更好地开发以小鱼仙草总黄酮为主的药物及其制剂提供了实验参考。
1 仪器与试药
WND200A型高速中药粉碎机(上海微型电机厂)、S22PC可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)。小鱼仙草药材于2008年10月采自浙江永康，经俞冰副教授鉴定为小鱼仙草Mosla dianthera Maxim.的地上部分，阴干，粉碎，备用。芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所(批号：10008020030)，所用试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2.1 总黄酮的含量测定
精密称取105℃干燥恒重的芦丁对照品10.6 mg，加50 %乙醇溶解定容于50 mL容量瓶，得浓度为2.12 mgomL-1标准品溶液。精密吸取标准品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分别置25 ml容量瓶中，加5 % NaNO2 1.0 mL，摇匀，放置6 min后加10 % Al(NO3) 3 1.0 mL，摇匀，放置6 min后再加10 % NaOH 10 mL，加50 %乙醇稀释至25 ml，混匀，静置15 min，同行试剂作空白，于510 nm处测定吸光度[10]，以吸光度值为纵坐标，以芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A= 0.5464C + 0.0056 ，r = 0.9997，结果表明芦丁在0.212～1.272 mg范围内线性关系良好。
2.2 提取工艺研究
根据BoxBenhnken的中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，在选定乙醇浓度为70%、提取温度为90℃的前提下，选择溶媒倍数、提取时间和提取次数3个因素作为自变量设计响应面分析实验，分别以X1、X2、X3表示，每个自变量的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码，以小鱼仙草总黄酮提取得率作为响应值Y。实验因素及水平安排见表1。表1 实验因素及水平安排表
分别精确称取小鱼仙草干燥药材粉末 5.0 g，根据表1选择的因素和水平，70% 乙醇回流提取，过滤，加同浓度的乙醇溶液定容至250 mL，摇匀，作为供试品溶液。精密移取0.3 mL供试品溶液，测定总黄酮含量，计算总黄酮提取得率，结果见表2。表2 响应面实验安排及结果(n=3)注：共有15个实验，其中12个为析因实验，3个为中心实验以估计误差。
采用SAS 9.1.3软件对表2结果进行响应面回归分析，得拟合方程：Y=8.436667+0.11X1 +0.2X2 +0.2425X3-0.107083X12+0.1775X1X2 +0.0625X1X3 -0.077083X22 +0.1575X2X3-0.172083X32(R= 0.9622)。并作回归方程显著性检验及方差分析，结果见表3。表3 回归方程的显著性检验及方差分析结果.