HPLC法鉴别大黄及部分含大黄中成药的真伪

【摘要】目的：建立一种简便且可靠地鉴别大黄及含大黄中成药物真伪的方法。方法：采用Lichrospher C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-水(35：5：60)，流速1.0ml/min，检测波长320nm，对正品大黄、伪品大黄及以正品大黄所生产的清肺抑火片中土大黄苷含量进行测定。结果：土大黄苷进样量在0.316-3.69ug范围内与峰面积呈良好的线形关系(r=0．998)，平均回收率99.18%；伪大黄即河套大黄中检测出土大黄苷，而正品大黄及其中成药制剂清肺抑火片中均未检出土大黄苷。结论：该方法简便、快速、准确可靠，具有良好的重现性和灵敏度高，可作为鉴别大黄及部分含大黄中成药真伪的有效方法。
【关键词】 高效液相色谱法；河套大黄；土大黄苷；清肺抑火片 

        国家药典规定，正品大黄来源于蓼科，属于掌叶组植物的干燥根及根茎。以个大，色黄而得名。品种包括掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄，主产地在四川、青海、甘肃等地，栽培或野生，产量并不大[1]。伪品大黄主要来源波叶组的波叶大黄，包括河套大黄、华北大黄、藏边大黄等，主产地在华北、新疆、西藏、青海等地。波叶组的伪品大黄产量大，流散广，市场中较为常见，但其并非药典收藏的正品大黄，因此均属伪品。正品大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效，是临床较为常用的一种药品。而伪品大黄则不具备这样的功效。目前由于正品大黄产量有限，市面上涌现出大量伪品大黄以假乱真、以次充好，严重干扰医疗市场，甚至威胁患者的生命健康，因此，鉴别大黄真伪至关重要。正品大黄无论从宏观还是微观，甚至理化性质检测结果均与伪品大黄有着很大区别，鉴定的方法也多种多样。本文采用高效液相色谱法（HPLC法）对大黄真伪进行鉴别，并选取清肺抑火片为含大黄中成药物的代表，鉴定其所含大黄真伪，现报道如下。
        1方法
        1．1 仪器与试药：仪器：日本岛津（LC-2010A）高效液相色谱仪；TG332A型微量分析天平(上海分析天平厂)。试药与试剂：土大黄苷对照品，批号110756-200110，来源于中国药品生物制品检定所；河套大黄取自本省药品检验所药材标本室，正品大黄药材购自我省药材公司，上述2种药材均经本所主任药师鉴定。清肺抑火片市售品购自永安大药房，生产厂家云南金柯制药有限公司，批号20094331。
        1．2色谱条件:色谱柱为Lichrospher C18柱(0.25cm×4.6mm，5um)，流动相为甲醇-乙腈-水(35：5：60)，检测波长320nm。流速1mL/min，SYG柱温25℃。
        1.3 对照品溶液的配制:精密称取土大黄苷对照品3.39mg，置25mL量瓶中，以甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液。
        1．4 供试品的制备:取正品大黄及河套大黄，研成细粉，精确称取药材1．0 g，加入甲醇25ml，超声处理后，过滤，滤渣用少量甲醇洗涤3次，合并滤液和洗液，减压浓缩，残渣加甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。取清肺抑火片20片，去包衣后精密称量、研细，再精密称取适量(约相当于2片量)，置锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，超声振荡20min，放冷，用甲醇补充至刻度，精密吸取续滤液10mL，即为供试品液。
        2 结果
        2．1 色谱条件及系统适用性:色谱柱：Lichrospher C18(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-水(35：5：60)，流速1.0ml/min，检测波长320nm，色谱图见图1。 
         
        图1 A 对照品B  河套大黄C 正品大黄
        2．2线性关系:精密称取土大黄苷对照品14mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL分别含0．28mg、0．32mg、0．16mg的混合液。作为对照品储备液，各吸取对照品储备液50、100、200、300、400、500、600于5mL量瓶中，用甲醇定容。进样测定，以对照品进样量为横坐标，峰面积分值为纵坐标绘制工作曲线，得到回归方程：Y=0.37+2648.20m，r=0．998。结果表明，土大黄苷进样量在0.316-3.69ug时，峰面积与进样量呈良好线性关系。
        2．3精密度试验:精密量取对照品溶液，重复进样6次，每次进样量10ul，测得土大黄苷含量，相对标准差RSD为0．28%。
        2．4 加样回收率试验:精确称取已测定的大黄样品5份，每份0.25g，分别精密加入对照品储备液1.3mL，对照储备液1.6mL，按照供试品溶液制备同法操作并按上述条件测定。结果为99.18%，RSD为0.82%。
        2．5 样品稳定性试验:按供试品液制备方法处理，并按色谱条件测定记录色谱图，以外标法峰面积计算RSD为0.61%。结果表明：供试品溶液室温下放置在12小时内稳定。
        2.6 样品测定:取河套大黄样品及清肺抑火片分别按上述方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液及对照品溶液各5 uL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算样品中土大黄苷的含量及RSD。结果显示：河套大黄含土大黄苷4.05%，RSD0.41%；清肺抑火片及正品大黄中不含土大黄苷。