Synphilin1寡核苷酸对帕金森病酪氨酸羟化酶表达的影响
【摘要】 目的 探讨Synphilin1对帕金森病（PD）酪氨酸羟化酶（TH）表达的影响。方法 50只SD大鼠随机分成5组，每组10只。PD组大鼠右侧黑质注入6羟多巴3 μL制作PD模型，反义组、同义组、错义组分别注入Synphilin1反义寡核苷酸、同义寡核苷酸、错义寡核苷酸各3 μL， 正常对照组右侧黑质注入2 g/L抗坏血酸生理盐水。取鼠的术侧脑黑质制作切片，利用免疫组化方法检测Synphilin1表达，利用免疫组化、Western blot、原位杂交方法检测TH的表达。结果 与正常对照组比较，PD组Synphilin1蛋白表达显著增加，TH蛋白和TH mRNA表达显著减少；与PD组比较，Synphilin1反义组TH蛋白和TH mRNA表达显著增多。结论 Synphilin1可能通过影响TH的表达对帕金森病的发病机制产生影响。
【关键词】 Synphilin1 酪氨酸单氧化酶 帕金森病 大鼠
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of synphilin1 on tyrosine hydroxylase (TH) expression of Parkinson disease. MethodsFifty healthy male SpragueDawley rats were divided evenly into five groups. PD group: PD models were made by unilateral stereotaxic infusion of 3 μL of 6hydroxydopamine (6OHDA) in right substantia nigra. Antisense group, sense group and missense group were given antisense, sense, and missense oligonucleotides respectively. Control group: natrium saline was injected into right substantia nigra. The expression of synphilin1 protein was detected by immunohistochemistry, and expression of TH protein and mRNA immunohistochemistry, western blot, and in situ hybridization. ResultsCompared with control group group, the expression of synphilin1 in PD significantly increased, and the expression of TH decreased. Compared with PD group, the expression of TH protein and TH mRNA in antisense group significantly increased. ConclusionSynphilin1 may affect the pathogenesis of PD by affecting the TH expression.
［KEY WORDS］synphilin1; tyrosine3monooxygenase; Parkinson disease; rats
帕金森病（PD）是遗传易感性和环境因素共同作用的结果，其主要的病理改变是黑质Lewy小体（LB）形成和神经元缺失。已有文献表明，αsynuclein蛋白是LB的主要成分［1］，该蛋白的聚集和异常表达，对LB的形成及PD的发生均具有重要意义［2，3］。1999年有人在LB中发现另一个蛋白，它能与αsynuclein蛋白相互作用，命名为Synphilin1［4］，推测它在PD的发病机制中可能具有重要意义。本文应用PD动物模型，研究该蛋白异常表达对酪氨酸羟化酶（TH）的影响，以探讨它在PD发病机制中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物分组及处理方法
选择50只健康的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠（购自广东省医学实验动物中心及中山大学实验动物中心），体质量210～240 g。随机分成PD组、反义组、同义组、错义组、正常对照组, 每组10只。PD大鼠模型的制备如下：100 g/L水合氯醛（3～4 mL/kg体质量）腹腔注射麻醉大鼠，参照鼠脑立体定向图谱［5］，将大鼠固定在脑立体定向仪上，剪去头顶部毛，局部消毒，在正中从前向后切开大鼠头顶皮肤，分离颅骨表面的软组织，暴露右侧顶骨。以前囟为坐标原点，对右侧黑质定位，其坐标为：前囟后5.0 mm,矢状缝右侧1.5 mm,颅骨骨面下8.8 mm。PD组右侧黑质用微量注射器注入6羟多巴（6OHDA）18 μg（3 μL）,注射速度为1 μL /min, 术毕留针10 min。反义组连续2 d注入Synphilin1反义寡核苷酸3 μL,第3天注入6OHDA 3 μL；错义组注入Synphilin1错义寡核苷酸代替反义寡核苷酸；正义组注入Synphilin1正义寡核苷酸代替反义寡核苷酸；正常对照组黑质内注入2 g/L抗坏血酸生理盐水混合液3 μL。各组均在术后第4周采用100 g/L水合氯醛（5 mL/kg体质量）腹腔注射麻醉，快速断头取脑，切除右侧中脑腹侧制作标本，冷冻，切片。
1.2 实验方法
1.2.1 Synphilin1寡核苷酸(ODN)的设计和合成参照Genbank提供的大鼠Synphilin1 mRNA序列，设计了跨越Synphilin1 mRNA翻译起始区和编码区的两条反义寡核苷酸，分别为Antisense 1(AS1)：5′TCAGGGGCTTCCATTATTCT3′, Antisense 2(AS2)：5′GGGATGGTCTTGAGAGAGGT3′，经PCRDESN软件分析两条反义寡核苷酸之间无发夹结构、互补结构。同时设计相应的正义寡核苷酸和错义寡核苷酸作为对照，序列分别如下。正义：5′AGAATAATGGAAGCCCCTGA3′， 错义：5′GAATAAATAAGGCGCCTCAG3′。由武汉博士德公司合成。
1.2.2 Synphilin1、TH蛋白表达的定性检测 采用免疫组化法检测Synphilin1、TH蛋白表达。首先制备石蜡包埋切片，片厚5 μm,抗体购自Chemicon公司，严格按照试剂盒说明书操作，TH按1∶4 000稀释，Synphilin1按1∶3 000稀释，采用ABC法染色。每个标本在高倍镜（200倍）下观察，随机取3个视野，采用德国KONTRON IBAS 2.0 全自动图像分析系统，分别计数Synphilin1、TH阳性细胞数。
1.2.3 TH蛋白表达的半定量检测 采用Western blot方法，首先采用三去污剂裂解缓冲液提取术侧中脑腹侧的总蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，抗体孵育，曝光。采用德国KONTRON IBAS 2.5 全自动图像分析系统分析结果。所用抗体购自Chemicon公司。
1.2.4 TH mRNA表达的检测 采用原位杂交方法，地高辛标记的多项寡核苷酸探针及地高辛检测试剂盒均购于武汉博士德公司，TH原位杂交探针序列为：5′GTTTG AGACA TTTGA AGCCA AAATC CACCA3′(大鼠)；以杂交液中不加地高辛标记的探针作为阴性对照。严格按照试剂盒说明书进行操作，采用ABC法染色。每个标本在高倍镜下（200倍）观察，并随机取5个视野，采用德国KONTRON IBAS 2.0 全自动图像分析系统，计数TH mRNA表达阳性细胞数。
1.3 统计学处理
采用SSPS软件进行统计学处理，数据间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 各组Synphilin1蛋白表达比较
正常对照组、PD组、反义组、正义组、错义组Synphilin1免疫组化阳性细胞数分别为98.15±26.12、153.50±13.89、 108.50±26.75、 146.75±21.18、 153.00±18.23个。与正常对照组比较，PD组、正义组、错义组Synphilin1阳性细胞数显著增多，差异有显著性（F=5.963，q=4.36～5.10，P<0.05）；反义组差异无显著性。
2.2 各组TH蛋白表达免疫组化检测结果（IH）及其比较
与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH阳性细胞数显著减少，差异有显著性。与PD组比较，反义组TH阳性细胞数显著增多，差异有显著性；正义组、错义组无明显差异。见表1。
2.3 各组TH mRNA表达原位杂交检测结果及其（ISH）比较
与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH阳性细胞数显著减少，反义组未见减少。与PD组比较，反义组TH阳性细胞数显著增多，正义组、错义组无明显差异。说明PD时TH的表达减少，Synphilin1反义寡核苷酸阻断能够提高TH的表达。见表1。表1 各组TH免疫组化和原位杂交阳性细胞计数及其比较与正常对照组比较, F=5.984 、13.188，*q=6.25～8.20,P<0.01; 与PD组比较， △q=4.13, P<0.05 ； △△ q=5.77, P<0.01
2.4 各组TH蛋白表达Western blot半定量检测结果比较 正常对照组、PD组、反义组、正义组、错义组TH蛋白半定量检测结果分别为902.51±62.93、614.13±57.58、980.83±102.28、730.13±90.52、584.65±88.36，与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH表达量显著减少，差异有显著性（F=13.556，q=3.63～6.70,P<0.05、0.01）；反义组差异无显著性。与PD组比较，反义组TH表达量显著增多（q=4.13, P<0.01），正义组、错义组无显著差异。