金纳多对RCS鼠视网膜色素变性神经元保护作用
【摘要】 目的 探讨金纳多（Ginaton，EGb761）对RCS大鼠视网膜色素变性神经元保护作用的机制。方法将出生后雄性RCS大鼠48只随机分为给药组和对照组。给药组大鼠从生后7 d开始腹腔注射金纳多，每3 d注射一次，剂量为100 mg/kg。对照组大鼠注射生理盐水，剂量相同。苏木精伊红染色和TUNEL检测观察EGb761对视网膜色素变性神经元的保护作用。应用免疫组织化学方法检测Caspase2蛋白的表达。结果 给药组大鼠生后20和25 d，感光细胞的数目与对照组大鼠比较明显增加（t＝3.32、3.56,P<0.05）。给药组大鼠生后25 d TUNEL检测阳性细胞数目比对照组少，差异有统计学意义(t＝3.74,P<0.05)。生后25～40 d，给药组和对照组大鼠在节细胞层和内核层观察到Caspase2阳性染色。给药组大鼠生后20和25 d时内核层Caspase2阳性细胞数少于对照组（t＝2.87,P<0.05）。结论 在RCS大鼠视网膜变性的早期，EGb761对神经元起保护作用，其作用机制可能与Caspase2蛋白的低表达有关。
【关键词】 视网膜炎 色素性 金纳多 细胞凋亡 Caspase2蛋白 大鼠
［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the protective mechanisms of Ginaton (EGb761) on hereditary retinal dystrophy in RCS rats.MethodsA total of 48 male RCS rats were randomly divided into treated and control groups. EGb761 100 mg/kg was injected intraperitoneally, once every three days in treated group， starting from seven days after birth； saline was given to the controls, dose and medication being the same as the treated group. The protective effect of EGb761 against retinal dystrophy was assessed by HE staining and TUNEL. The expression of Caspase2 was detected by immunohistochemistry. ResultsThe number of photoreceptor in the treated group was more than that in the controls at 20 and 25 days after birth （t＝3.32,3.56;P<0.05）. Twentyfive days after birth, the number of TUNELpositive cells of the treated group was obviously less than that of the controls (t＝3.74,P<0.05). From 25 to 40 days after birth, the Caspase2positive cells were seen in the ganglion cell layer and inner nuclear layer in both treated and control groups. The number of positive cells in the inner nuclear layer of treated group was less than that of the control group （t＝2.87,P<0.05）. ConclusionEGb761 has a protective effect on the early stage of retinal degeneration of RCS rats, its mechanisms may be related to the low expression of Caspase2.
［KEY WORDS］retinitis pigmentosa; EGb761; apoptosis; Caspase2 protein; rats
视网膜色素变性是一种眼科十分常见的致盲性疾病，到目前为止，其发病机制尚不清楚，亦无有效的防治办法。1938年，BOURNE等［1］首次报道了自发性蜕变的鼠种——RCS(Royal College of Surgeons)大鼠，人们基于这一动物模型进行了大量研究。RCS大鼠主要表现为视网膜色素上皮（RPE）不能有效吞噬感光细胞外节脱落的膜盘，致使膜盘堆积，感光细胞变性［2］。随着凋亡概念的提出，1994年TSO等［2］认为RCS大鼠感光细胞变性是通过凋亡的途径实现的。金纳多（Ginaton，EGb761）是从银杏叶中提取的复合物，可以增加脑血管的血流量，保护脑细胞，清除有害的氧化自由基，并有显著的抗凋亡作用［3］。本实验从感光细胞开始凋亡时观察EGb761对神经元的保护作用，并探讨EGb761的作用机制，为临床上日益增多的视网膜色素变性疾病的治疗提供实验和理论依据。
1 材料与方法
1.1 组织来源
出生后雄性RCS大鼠48只，随机分为给药组和对照组。12 h光照12 h黑暗循环条件下饲养，自由饮食、饮水。给药组大鼠从生后7 d开始腹腔注射EGb761，每3 d注射一次，剂量为100 mg/kg。对照组大鼠从生后7 d开始腹腔注射同剂量生理盐 水。两组大鼠分别在生后15、20、25、30、35、40 d处死，取其视网膜组织，观察EGb761对感光细胞的保护作用。
1.2 标本制作
水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉动物后，取出眼球，冲洗后立即放入40 g/L多聚甲醛中固定6 h，去眼前节及玻璃体，依次放入100 g/L蔗糖中2 h，200 g/L蔗糖中2 h，300 g/L蔗糖中过夜。用OCT包埋剂填满眼球,沿眼球矢状面作连续冷冻切片，厚度5 μｍ，依次行苏木精伊红、TUNEL、Caspase2染色。
1.3 检测方法
原位细胞凋亡检测和Caspase2免疫组化检测均按常规操作。原位细胞凋亡检测阴性对照切片不加末端核糖核酸转移酶，阳性对照切片在反应前先用DNA酶Ⅰ消化。Caspase2免疫组化检测阴性对照切片不加一抗。
1.4 结果判定
采用激光共聚焦显微镜（OLYMPUS,IX81）获得数值显微图像。用8比特1 024×1 024像素的20倍放大的显微图像。TUNEL阳性表达为细胞核呈绿色荧光，测量视网膜每100 μｍ长视野内阳性细胞数。Caspase2阳性表达为细胞膜或胞浆呈黄色或棕黄色染色。每张切片取4个视野，用光学显微镜在200倍视野下观察，计数每100 μm长视野内阳性细胞数。
2 结 果
2.1 苏木精伊红染色
2.1.1 对照组 大鼠生后15 d视网膜还未发育成熟。20 d时，视杆层厚度增加，内节变窄，外节增厚，有排列紊乱及空泡现象。25 d时，感光细胞数目有所下降。30 d时，感光细胞染色加深，其数目减少，外节形态不规则，内节明显变窄。35 d时感光细胞数目与30 d相比明显减少。40 d时，感光细胞数目与35 d相比明显减少，视网膜色素上皮细胞可见排列紊乱，体积增大，外形不规则。60 d时，仅有少许感光细胞存在，平均细胞计数为（9.80±2.59）个。内核层（INL）细胞、神经节细胞形态和数目基本正常。
2.1.2 给药组 大鼠生后15 d，外核层（ONL）感光细胞数目与对照组大鼠相比无明显差别（t＝1.36，P>0.05）。20 d时，感光细胞数目比对照组细胞数目多（t＝3.32,P<0.05）。25 d时，给药组大鼠感光细胞数目较20 d时有所下降，但与对照组相比明显增加（t＝3.56,P<0.05）。见表1。
2.2 TUNEL检测
对照组大鼠生后25 d，ONL可以观察到少许TUNEL反应阳性的细胞核。30 d时，TUNEL反应阳性细胞核数目明显增加。35 d时阳性细胞核数目最多。40 d时，阳性细胞核数目较35 d时减少。给药组大鼠生后25 d，ONL也可以观察到TUNEL反应阳性的细胞核，阳性细胞计数与对照组相比，差异有统计学意义(t＝3.74,P<0.05)。其余时间段无明显差异。见表2。
2.3 Caspase2检测
生后20～40 d，给药组和对照组大鼠在节细胞层和INL观察到Caspase2阳性染色。给药组大鼠在20 d和25 d时INL的Caspase2阳性细胞数多于对照组（t＝2.87,P<0.05），其余各时间段差异无显著性。给药组、对照组大鼠INL的Caspase2染色阳性细胞均在生后35 d达到高峰。见表3。表1 两组不同日龄大鼠视网膜每30 μm长视野内ONL感光细胞数目的变化表2 两组不同日龄大鼠视网膜每100 μm长视野内TUNEL检测阳性细胞数表3 两组不同日龄大鼠视网膜每100 μm长视野内INL的Caspase2阳性细胞数