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［关键词］ HBV;抗原表位;抗原性;FHV?RNA2载体系统
Study on Antigenicity of HBV Recombinant Epitope
Abstract：Objective Construction and Expression HBV recombinant epitope in a foreign epitope presenting vector，and evalution of dignostic sensitivity for anti?HBs with HBV epitope. Methods Oligonucleotids encoded twenty?four amino acids(aaS124?147) which is within "a" antigenic deterninant were synthesized and inserted into a foreign epitope?presenting carrier I3 site (FHV?RNA2?cDNA?I3). HBV epitope was expressed in a prokaryotic cellular system(BL21 cell). The expression product was analyzed and its antigenicity was further studied by ELISA and Wstern blot method with chimeric protein as coating antigen.we used chimeric protein as coating antigen to test anti?HBs with ELISA and Wstern blot in 58 seral samples. Results The chimeric protein reacted with anti?HBs seral specially.The detection positive ratio of anti?HBs is 77.5% and 68%respectively by ELISA and Wstern blot with chimeric protein as coating antigen,the control's was 62%.Conclusion HBV epitope expressed in a foreign epitope?presenting carrier possessed good antigenicity and diagnostic value.Key words：HBV；Epitope；Antigenicity；FHV?RNA2 carrier system
乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原体，并引起慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生密切相关。迄今，对HBV感染最有力的预防和控制措施，仍是疫苗。FHV?RNA2载体系统［1］是一个以昆虫小RNA病毒flock house virus外壳蛋白为载体的新型抗原表位表达载体，此系统中表达的载体蛋白可自动组装成病毒样颗粒，使插入的外源抗原表位可以暴露在颗粒的表面，保持天然构象和免疫学特性。本研究拟将HBV a抗原表位插入到FHV外壳蛋白上，并对其抗原性及诊断意义进行了研究。
1 材料与方法
1.1 细胞 重组质粒DNA大肠杆菌DH5α用于重组质粒pET?E DNA的克隆和扩增。大肠杆菌BL21(DE3)用于重组质粒pET?E DNA的表达。质粒DNA在含200 μg/ml氨苄青霉素的LB或TB培育中生长，FHV?RNA2载体系统即重组pET?FHV构建见［1］。
1.2 HBV抗原表位及重组pET?E的构建和表达
1.2.1 HBV抗原表位及重组pET?E的构建 人工合成HBV特异抗原表位E(氨基酸序列：124CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC 147)寡核苷酸序列：正向5’GA TGC ACG ACT CCT GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCA TGT TGC TGT ACA AAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC 3’；反向3’CT ACG TGC TGA GGA CGA GTT CCG TTG AGA TAC AAA GGG AGT ACA ACG ACA TGT TTT GGA TGC CTA CCT TTA ACG 5’，两端为Bsu36I识别位点，与经Bsu36I作用后的重组pET?FHV DNA混匀后置室温连接2 h,转化DH5α细胞，接种LB平板(200 μg/ml Amp)培养。重组质粒pET?E DNA经酶切筛选并经DNA序列测定。
1.2.2 携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达 重组pET系统中，嵌和蛋白的表达受T7启动子的控制［2］。BL21经重组pET?E DNA转化后，在TB培养液中37 ℃生长16 h～18 h,细胞经4 000 r/10 min离心沉淀,用超声裂解缓冲液悬浮，超声裂解，裂解液经离心，弃上清，沉淀(包涵体)用8 mol/L尿素溶解。
1.2.3 SDS?PAGE及Western blot分析 方法见前文［1，3］，3，3?二氨基苯胺四氢盐酸(DAB)底物试剂为AMRESCO公司产品;第二抗体?辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司。
1.3 HBV重组抗原表位诊断意义评价
1.3.1 ELISA检测血清样本 固相ELISA检测如前文所述［1］，以纯化的嵌和蛋白为包被抗原，每孔100 μl(含1 μg纯化嵌和蛋白)，检测58份乙肝患者血清中抗?HBs，与抗?HBs ELISA检测试剂检测结果比较。阳性判断标准为(检测血清A492?底物对照A值)/(阴性血清A492?底物对照A值)>2.1。邻苯二胺二氢盐酸(OPD)购自AMRESCO公司；第二抗体?辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司；乙肝患者血清由昆明市传染病收集;抗?HBs ELISA检测试剂盒购自上海科华公司。
1.3.2 HBV重组抗原表位Western blot检测血清样本 方法见前文［3］，检测了58份乙肝患者血清样本。
2 结果
2.1 携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达 FHV?RNA2?cDNA载体系统即重组pET?FHV构建见［4］，其编码产物是FHV外壳蛋白，三维立体结构已得到精确测定，其上有6个可供外源抗原表位插入的位点［5］(见图1)。应用该系统，我们将人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重组pET?FHV DNA上，构建携带HBV抗原表位的重组质粒pET?E，经NsiⅠ和NcoⅠ双酶切筛选(见图2)和DNA序列测定无误后转化BL21细胞，高水平表达嵌和蛋白。经SDS?PAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)和Western blot(见图4)分析结果表明，这些嵌和蛋白为携带有HBV抗原表位的重组FHV外壳蛋白。
图1 FHV外壳蛋白的三维结构：示可供选择的外源抗原表位序列插入位点?L1、L2、L3、I1、I2，I3?HBV抗原表位氨基酸序列在FHV中插入位点。（略）
图2 重组质粒NcoⅠ+NsiⅠ酶切图（略）
2.2 携带HBV重组抗原表位的嵌和蛋白在BL21中的表达与鉴定 携带HBV抗原表位的重组质粒pET?FHV?E在BL21(DE3)转化细胞中高水平表达了携带HBV抗原表位的嵌合蛋白FHV?E,其分子质量与阳性对照相同，约为45 000(等于载体FHV外壳蛋白的分子质量43 000加上HBV抗原表位的分子质量)。经SDS?PAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)及Western blot(见图4)分析结果表明，重组抗原表位显示了抗原性。
图3 携带HBV a特异抗原表位的嵌合蛋白SDS?PAGE(10%)分析（略）
图4 嵌合蛋白的Western blot分析（略）
2.3 HBV重组抗原表位ELISA检测敏感性分析 我们用嵌和蛋白为包被抗原用间接ELISA法检测58份乙肝患者血清中抗?HBs抗体，检测阳性率为77.5%，高于ELISA试剂盒检测的62%。
2.4 HBV重组抗原表位Western blot 以嵌和蛋白为包被抗原用Western blot检测58份乙肝患者血清中抗?HBs抗体，检出阳性率为68%。
3 讨论
3.1 HBV a抗原表位在疫苗及诊断应用研究中的意义 根据HBsAg S蛋白的抗原性不同，将HBV分为9个血清型(即HBsAg亚型)［6，7］：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-、adrq+。HBV S蛋白第120～第160氨基酸序列是HBV的交叉中和抗原表位即a表位［8］，可诱导产生交叉中和抗体，保护成人免受各HBV亚型的感染。本研究进一步表明，HBV a重组抗原表位可与临床不同来源的血清抗?HBs发生特异性结合，具有疫苗研究和诊断意义。
3.2 新型抗原表位表达载体系统 对于抗原表位来说，决定其免疫原性和抗原性的因素除了氨基酸序列，更重要的是分子的空间构象和呈递给免疫细胞识别的方式。利用FHV?RNA2表达载体在大肠杆菌中表达的抗原表位具有良好的免疫原性，免疫小鼠产生了交叉中和抗体［9］，并已成功的在该系统中表达了HIV?1 V3、轮状病毒Vp4抗原表位和HCV抗原表位，并诱导中和抗体和交叉中和体产生［1，10，11］。HBV抗原表位在FHV?RNA2载体系统可中高效地表达，并近似天然构象，能被天然抗?HBs抗体特异性识别结合，具有良好的抗原性，在以其为包被抗原用ELISA和Wetern blot检测抗?HBs中检测敏感性与ELISA诊断试剂盒差异无显著性，在HBV诊断试剂和重组抗原表位亚单位疫苗研究中具有重要意义。
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