ELISA法测定粪样中性激素含量的应用前景

　　摘要目前的研究表明,从野生动物粪便中提取并测量性激素能取得较好的结果,这是由于该方法具有其他方法所无法比拟的独特优点。粪便激素测定的首要优点是安全无伤害性,能在不对动物进行镇静和限制的情况下收集数据;其次,粪、尿类固醇激素测定作为一种非侵害性的方法,在自然状态下监测野生动物生殖内分泌状态,具有简单、准确的优点。ELISA检测方法灵敏度高,特异性好,方便,简单,易于操作,检测结果可靠性高,已广泛应用于粪便临床检测和血液、尿液中的性激素检测。随着ELISA激素的不断发展完善,以及越来越多的应用粪便激素分析方法进行科学研究,运用ELISA方法进行粪便激素测定具有广阔的应用前景。
　　关键词ELISA法;性激素;RIA;BAS-ELISA;HD-HOOK效应
　　
　　利用粪便中激素代谢产物的化学分析代替血样分析,可以检测动物的繁殖和肾上腺皮质激素状态的各种指数[1-3]。样本的采集在不打扰实验动物的情况下很容易做到,而且样本可以在一段时间内有规律的收集,这样在不影响动物内分泌状态下,重复对同一个体取样,可以测量在长时间内动物对特殊环境或特定处理的短期激素水平变化。另外,粪便中激素水平是一段时间内总的激素量,受激素分泌的波动影响很小,既避免了对实验动物的侵扰,也不会出现因捕捉而使动物产生应激反应,可以反映动物在长时间内激素水平变化。因此,粪便样本可以很精确的代表动物激素的状态。
　　1酶联免疫测定法和放射性免疫测定法的比较
　　目前,常用的激素测定方法主要包括生物学方法、化学方法及免疫测定方法。其中,已经用于检测粪样中性激素含量的免疫学方法有放射性免疫检测法和酶联免疫检测法[4-7]。所谓放射性免疫,就是生物化学中的免疫分析,加上放射性“标记”,创立的一种新的生物化学分析方法[8]。由于放射性免疫检测灵敏度高,且方法成熟,因此测量结果可信度高,是目前应用最广泛的性激素测定方法,已用于朱鹮、麋鹿、马鹿等物种粪样性激素的测定[9-10]。但在应用这一方法时,会产生不同程度的辐射环境影响:一是放射性药品使用过程对操作人员γ射线辐射影响;二是放射性废物对环境的污染影响。因此,对实验室防护条件要求较高,不宜普及使用。酶联免疫法虽然灵敏度略逊放射性免疫测定法,但是比放射性免疫测定法简单、安全,易于普及,且测量结果与放面结果有较强的相关性。目前酶免技术已用于小熊猫(Ailurus fulgens)、亚洲鲇鱼(Hypophthalmichthys molitrix)、牛(Bos taurus domesticus Gmelin)等物种粪样的激素检测。随着酶免测定灵敏度的进一步提高,它在医学和生物学领域激素检测方面的应用将会越来越广泛。
　　2酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)分类
　　ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体[11]。在这种测定方法中有3个必要的试剂:固相的抗菌素原或抗体,即免疫吸附剂(immunosorbent);酶标记的抗原或抗体,称为结合物(conjugate);酶反应的底物[12]。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。目前已经广泛应用的ELISA方法包括双抗体夹心法、间接法、竞争法以及ABS-ELISA法,其中竞争法适合测小分子抗原,因此针对不能采用双抗体夹心法测定的小分子抗原,如人绒毛膜促性腺激素、甲状腺激素,可以用竞争法测定;双抗体夹心法和ABS-ELISA法由于灵敏度高,能够满足粪样激素测定的灵敏度要求,因此在粪样的激素测定中有广泛的应用前景。
　　2.1双抗体夹心法
　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,用双异性抗体进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗原[13]。双抗技术曾被应用于测定血液、母乳中的激素。在非损伤性检测方面,曾宪垠等人运用双抗夹心法测定雌性大熊猫被毛中孕酮的含量,最小可测量到0.15 pg/孔。由于该检测技术的灵敏度相对较高,而且改良的夹心法灵敏度能够进一步提高,因此能满足粪便激素测定的灵敏度要求。
　　2.2竞争法
　　小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的2个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法进行测量。在激素测定中,属于竞争法的有固相法(solid phase method)、双抗体(double antibody method)和均相酶免疫法(homogeneous EIA),一般用于甲状腺激素、肾上腺皮质激素、雌性激素等的测定。竞争法的灵敏度一般能达到10 ng/mL,甚至2.2 ng/mL,主要取决于所选的试剂盒种类。
　　2.3BAS-ELISA法
　　BAS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的缩略语,具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点,操作方便,反应结果可用肉眼观察,试验成本低。BAS-ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(BAB)法2种类型。在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶标记的生物素进行显色。与BAB法相比,LAB法操作较简单,但灵敏度较低。何晓顺等[14]采用LAB法检测切除的病理标本中胆管上皮细胞角蛋白CK9和CK17、癌胚抗原、肝细胞蛋白,以判断肿瘤组织学来源。赵金富等(2004)通过简单的全合成获得了共价结合的雌三醇-生物素复合物(E3-Biotin),结合过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作为免疫分析探针,建立了灵敏的酶联吸附免疫分析新方法以测定血清中的雌三醇,标准曲线线性范围为0.1～10.0 ng/mL,检出限为0.06 ng/mL。Smith K A利用间接BAB法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg),其灵敏度比常规ELISA高1 000多倍。
　　3影响酶联免疫测定的因素及解决办法
　　目前ELISA方法已经被广泛用于粪便中的激素测量,或通过测量粪便中的某项指标作为各种疾病的临床诊断方法[15-16]。然而,由于一些干扰因素的影响,测量结果有时会出现偏差,造成假阳性或是假阴性。
　　3.1HD-HOOK效应
　　发生在固相法试验过程中,可造成“假低值”甚至“假阴性”错误结果的特殊效应。主要是由于在“一步法”中待测抗原总量过高,使得测定值随着抗原总量增加反而迅速下降。运用稀释测定法可以降低待测抗原总量,避免HD-HOOK效应,设计预试验,确定测量结果最佳的粪样用量也可以达到相同的目的。除此之外,初筛试验方法也能解决这一问题。
　　3.2边缘效应
　　由于抗原-抗体结合反应和酶促反应的速率,都具有温度依赖性,理应在恒温条件下完成全部试验过程。事实上,一般操作在室温,温育在37 ℃水浴。这种轮换操作过程,由于96孔板周边孔与内部孔升降温速率的差别,造成周边孔与内部孔结果的差异,可看作是一种“位置效应”。若室温和37 ℃悬殊过大时,可在板上加盖或贴密封膜,有一定效果。必要时,放弃周边孔不用,这样将造成37.5%(36/96)的资源浪费。
　　3.3弥散限制
　　在固相法中抗原抗体结合、底物与酶的接触、转换的信号产物向液体内弥散等过程中,液、固相中的分子必须穿过液面的Nernst层,也称液固屏障,使反应速率受到限制。采用振荡、离心、微波或超声等方法,可使Nernst层变薄,从而加速反应速率。