农兽药多残留免疫分析检测方法研究进展

　　摘要:综述了免疫分析法在拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、有机磷、氟喹诺酮、磺胺5种农兽药多残留检测上的应用情况,着重讨论了抗原设计、抗体制备和方法建立等核心技术的研究进展,并对检测方法的发展进行了展望。
　　关键词:农兽药;多残留;免疫分析法
　　AbstractThe applications of immunoassay methods in the multi-residue determination of pyrethroids,carbamate,organophosphorus,fluoroquinolones and sulfonamides were summarized in this paper. The study advancers on core techniques,such as antigen design,antibody production and method development,were discussed emphatically,and the further trend of immunoassay methods was proposed.
　　Key wordspesticides and veterinary drugs;multi-residue;immunoassay
　　
　　农兽药残留危害人们的生活健康,是食品安全检测的关注焦点。基于特异性抗体的酶免疫分析方法作为一种简便、快速和灵敏的检测方法,在近年来的食品安全检测中起到越来越重要的作用。采用酶免疫试剂盒、胶体金试纸条高通量、快速筛选阳性样品后,再用仪器确证的方法得到检验监测单位的普遍认可。已成功应用的检测产品有克伦特罗、莱克多巴胺试剂盒和试纸条等。其他如孔雀石绿、苏丹红、呋喃西林、恩诺沙星等快速检测产品也已投放市场,推广使用还需要一定时间的验证。然而一个不争的事实就是,对于检测如磺胺类、氟喹诺酮类、有机磷类、拟除虫菊酯类等有害物质时,使用单残留试剂盒并不比直接使用仪器具有优势。特别是检测农残的快速检测产品目前还不成熟,稳定性和假阳性等问题还未能很好解决。因此,如何同时检测一类药物,真正降低检测成本,并保证检测的准确性是目前农兽药的快速多残留检测的一种新趋势。
　　实现一类药物的多残留检测的基本思路是针对一类药物的共性结构设计并合成半抗原,由半抗原偶联载体蛋白制备全抗原,通过免疫动物制备抗体,利用抗体对一类药物的识别作用,建立多残留检测酶免疫分析方法[1-3]。
　　1农兽药的多残留现状
　　近年来,食品安全问题一直是困扰民生的焦点问题,而农兽药残留是制约食品安全的首要因素。2000年开始,广东省开展食品本底水平和污染监测项目,截至2005年的监测结果显示:蔬菜甲胺磷、敌百虫和敌敌畏检出率分别为7.95%、3.03%和2.65%,水果有机磷农药水胺硫磷检出率为10%,新鲜食用菌有机磷农药内吸磷检出率为8.33%,茶叶有机磷农药三氯杀螨醇检出率为5%,蔬菜氨基甲酸酯农药和拟除虫菊酯农药残留检出率为1.47%、17.17%,水果拟除虫菊酯农药检出率为20%。尽管国家加强了农药使用的监控力度,但是农药中毒事件和对外贸易摩擦仍时有发生。2008年1—2月,中日贸易过程中发生的“毒饺子”事件(有机磷农药中毒事件),使中国食品在日本市场遭受重创。而兽药方面主要是一些抗生素和兴奋剂的危害,如磺胺类、氟喹诺酮类、肾上腺素兴奋剂等。直到2009年2月初,广东仍有瘦肉精中毒事件发生,导致6~10人中毒。2009年6月1日,中华人民共和国食品安全法正式实施,表明了国家维护食品安全的力度。有了法律法规的约束作用,仍然不可缺少检测方法的支持。针对目前农兽药品种繁多,多残留现状严峻,开展多残留检测研究,尤其是能实现快速、高通量、现场筛查的免疫分析法的研究非常重要。
　　2免疫分析法在各类农兽药多残留检测上的应用
　　农兽药多残留酶免疫分析法的基本原理是根据待测一类药物的共性结构或共有结构特征,设计并合成突出其结构特征的半抗原,半抗原偶联大分子蛋白质作为全抗原并免疫动物,通过细胞融合获得杂交瘤细胞,收集并纯化杂交瘤细胞分泌的类特异性抗体(或称宽谱特异性抗体、广谱特异性抗体),利用抗体建立酶免疫吸附测定(ELISA)、免疫胶体金(GICA)等免疫分析法。
　　2.1拟除虫菊酯
　　拟除虫菊酯(Pyrethroids)农药是20世纪70年代研发的一类仿生杀虫剂,具有化学性质稳定,不易光解,无特殊臭味及安全系数高,使用浓度低,触杀作用强,灭虫速度快等优点。目前其酶免疫分析检测方法的研究已经开展比较多。Pullen等[4]直接采用氯菊酯的水解产物氯菊酸作半抗原,分别制备了具有不同交叉反应率的单克隆抗体和多克隆抗体,初步探索了2种抗体的类特异性。结果发现单克隆抗体可检测类型Ⅰ(菊酯类)拟除虫菊酯,对类型Ⅱ拟除虫菊酯(氰菊酯)没有交叉反应;而多克隆抗体既可检测类型Ⅰ拟除虫菊酯,又可检测类型Ⅱ拟除虫菊酯。Mak等[5]利用菊酸和间苯氧基苄醇合成的半抗原与甲状腺球蛋白结合制备Ⅱ型菊酯的免疫原并免疫动物获得多克隆抗体。由该抗体建立的ELISA方法检测氯氰菊酯、百树菊酯、氨氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和氟胺氰菊酯的IC50值为6~205 ng/mL,而对Ⅰ型菊酯无交叉反应。国内在这方面的研究包括有李志茹[6]、骆爱兰等[7]、杨挺等[8]、祝金凤[9]的报道。其中祝金凤设计合成了能模拟Ⅱ型菊酯类农药特征结构的半抗原(RS)-α氰基-3-苯氧基苄基(RS)-cis,trans-2,2-二甲基-3-羧基-环丙烷羧酸酯,用活泼酯法制备人工抗原,免疫新西兰大白兔获得抗Ⅱ型菊酯类农药的广谱特异性抗体。该抗体对5种Ⅱ型菊酯有识别作用,对氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯的灵敏度较高,间接竞争ELISA方法的检测限分别为11.7 ng/mL和48.5 ng/mL。
　　2.2氨基甲酸酯