农兽药多残留免疫分析检测方法研究进展

　　氨基甲酸酯类农药(Carbamate)具有杀虫谱广、用药量少、药效快等特点,目前对其检测主要采用高效液相色谱法和酶抑制法等,酶免疫多残留检测的研究报道很少。孙覃[10]合成了半抗原6-(苯氧基羰基)氨基-1-己酸并成功制备了芳基-N-甲基氨基甲酸酯类杀虫剂的通用抗体,抗体检测混灭威、灭除威、灭杀威、甲萘威的IC50值为0.47、0.65、1.08、0.53 μg/mL,其中混灭威在自来水、土壤以及青菜中的添加回收率分别为101.6%、87.7%和90.4%。
　　2.3有机磷
　　有机磷农药(Organophosphorus)通常是指磷(膦)酸酯、硫逐磷酸酯、磷酰胺酯类有机磷化合物。对于有机磷农药的多残留检测通常采用的是制备类识别特异性的抗体的途径。已有的报道都是针对二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯两大类有机磷农药的研究。自从1988年Sudi等[11],首先提出建立有机磷农药多残留检测的酶联免疫的方法后,国内外已有不少利用类特异性多克隆抗体建立二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯两大类有机磷多残留检测的报道[12-17]。Jang等[18]制备了O,O-二乙基-O-(5-羧基-2-氟苯基)硫代磷酰酯作为通用半抗原,偶联蛋白质作为人工抗原免疫小鼠,通过细胞融合体外培养杂交瘤细胞,获得单克隆抗体,并首次利用单克隆抗体建立了间接竞争ELISA的方法用于有机磷多残留检测是一个突破。该方法对4种含有二乙氧基有机磷农药的IC50值在0.1~0.3 μg/mL,克服了利用多克隆抗体建立的方法特异性较差的困难。梁颖等[19]设计了3个含二甲氧基二硫代磷酸酯共有结构的半抗原,制备出3个单克隆抗体,并建立ELISA方法,检测马拉硫磷、乐果、亚胺硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷可以达到限量标准,印证了Jang 采用单克隆抗体建立多残留检测方法的可行性。同时,还首次作了实际样品的检测,探讨了异源包被原对提高检测灵敏度的作用。
　　2.4氟喹诺酮
　　氟喹诺酮(Fluoroquinolones)类药物是一系列新型氟取代的喹诺酮类衍生物,广泛用于畜禽和水产养殖业。由于该类药物本身带有羧基活性基团,方便于酶免疫分析方法的应用。蔡勤仁等[20]利用碳二亚胺法合成恩诺沙星人工抗原,免疫BALB/c小鼠并采用杂交瘤技术制备了类特异性单克隆抗体,与恩诺沙星、环丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、达氟沙星的交叉反应率为27.4%~110.8%,检测限为0.13 ng/mL。魏东[21]利用活泼酯法制备了沙拉沙星人工抗原,免疫动物得到抗血清,并建立FQNS多残留检测方法。该方法对沙拉沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检测限为19.1~26.2 ng/mL。兔肉中4个药物在0.5~2 000.0 ng/mL范围内的平均添加回收率为85%。李振华[22]采用达氟沙星偶联牛血清蛋白的人工抗原制备的兔多克隆抗体能识别达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和洛美沙星,交叉反应率为22.7%~111.2%。王战辉等[23]采用环丙沙星直接偶联牛血清蛋白作为免疫原免疫动物并制备得到宽谱特异性抗体单克隆抗体,该抗体建立的方法检测12个氟喹诺酮的交叉反应率在35%~100%,最低检测限都可以达到最高限量检测要求。
　　2.5磺胺
　　磺胺(Sulfonamides)类药物是一类具有广谱抗菌活性的化学品,广泛应用与人和动物细菌性疾病的治疗和预防。该类药物的酶免疫多残留检测分析研究已经比较多。1991年,Sheth等[24]用化学方法合成了3种具有磺胺母核结构的半抗原TS、CS、NS,以磺胺噻唑衍生物TS偶联蛋白作为免疫原,制备了广谱特异性抗体。Muldoon等[25]以对氨基苯磺酸作为半抗原偶联载体蛋白后免疫动物,通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体能很好识别游离药物,检测磺胺硝苯、磺胺吡啶、磺胺噻唑的IC50值分别为1.41、22.80、322.00 ng/mL。ZHANG Hong-yan等[26]等设计并合成了5个对氨基苯磺酸衍生物作为半抗原,其中用对氨基苯甲酸作为手臂的半抗原偶联KLH后免疫新西兰大白兔得到的抗体最佳。利用其建立的异源直接竞争ELISA方法检测11个磺胺类药物的IC50值均小于100 ng/mL,其中磺胺异唑、磺胺噻唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺吡啶和磺胺甲噻二唑可以满足最高残留限量的要求,牛奶样品中药物的添加回收率为104%~131%。吕芳[27]以含五元杂环的磺胺类药物为研究对象,制备了族特异性单克隆抗体,建立的间接竞争ELISA方法,检测磺胺噻唑、酞磺胺噻唑、琥珀酰磺胺噻唑、磺胺甲噁唑及四者等浓度混合物的检测限分别为14.40、6.30、18.20、33.90、4.63 ng/mL。
　　3展望
　　目前,农兽药多残留免疫分析法的应用仍处于不成熟的阶段。限制其使用的因素,一是抗药物抗体的类特异性,二是免疫分析法本身的稳定性和灵敏度。前者是开发农兽药多残留免疫分析法的关键。目前的研究成果往往存在抗体谱宽足够但特异性不强或谱宽较窄但特异性较好的情况,真正能达到谱宽合适且特异性较好、检测一类药物的灵敏度相对一致的成果极少。而后者,检测方法的稳定性和灵敏度,是开发相应检测试剂盒产品的制约因素。目前的研究主要集中在制备类特异性抗体的层面上,涉及检测方法和试剂盒开发的研究较少。试剂盒的开发可见于一些专利,市面上销售的试剂盒极少,更多的是处于实验室研究阶段。
　　尽管农兽药多残留免疫分析法仍不成熟,但作为低成本、高通量、快速检测的一种检测方法,适应全面保证大众食品安全的时代需要,加上国家在这方面的投入,该方法有良好的发展前景。实际上,对于上述的限制因素已有一些研究报道[25-28]。对于抗体的类特异性,笔者认为:一是可以结合计算机模拟[29~30]等手段设计突出检测对象共性结构的半抗原,二是可以考虑用自制的树枝状大分子骨架定点、定量连接半抗原构成全抗原。结合这两者可以有针对性的设计合理的抗原,并使用这些抗原制备多克隆抗体或单克隆抗体。后续通过试验比较抗体的抗药物谱宽和特异性,选择谱宽和特异性都较佳的抗体用于检测方法的建立和检测产品的开发。对于检测方法的稳定性和灵敏度,笔者认为可以借鉴开发成功的单残留检测试剂盒的缓冲溶液体系,同时考虑多个药物提取液的优化问题以提高检测方法的稳定性;而灵敏度方面可以结合纳米技术,如量子点技术的应用,使检测灵敏度有数量级的提高。
　　4参考文献
　　[1] BRUUN L,KOCH C,JAKOBSEN M H,et al. Characterization of mono-clonal antibodies raised against different structures belonging to the s-triazine group of herbicides[J]. Analytica Chimica Acta,2001,436(1):87-101.
　　[2] BEIER R C,LAURA H R,COLIN R Y,et al. Production,character-ization and cross)reactivity studies of monoclonal antibodies against the coccidiostat nicarbazin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(10):4542-4552.